藥物分析第十一章抗生素

藥物分析第十一章抗生素含量測定或效價測定微生物學(xué)法——通過比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品產(chǎn)生抑菌圈的大小來測定供試品的效價。其原理恰好與臨床應(yīng)用要求一致，更能確定抗生素的醫(yī)療價值。對于分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分的抗生素，生物學(xué)法是首選的效價測定方法。第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天本法的優(yōu)點(diǎn)：靈敏、用量小，結(jié)果直觀適用范圍廣：純度好的、差的制品，已知或新發(fā)現(xiàn)的抗生素均適用，同一類型的抗生素不需分離，可一次測定其總效價。缺點(diǎn)：操作步驟多，測定時間長，誤差大等。第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天理化方法

——適用于提純的產(chǎn)品以及化學(xué)結(jié)構(gòu)已確定的抗生素優(yōu)點(diǎn)：迅速、準(zhǔn)確、有較高的專屬性。缺點(diǎn)：對含有具同樣官能團(tuán)雜質(zhì)的供試品不適用，或需采取適當(dāng)方法加以校正。而且當(dāng)該法是利用某一類型抗生素的共同結(jié)構(gòu)部分的反應(yīng)時，所測得的結(jié)果，往往只能代表藥物的總的含量，并不一定能代表抗生素的生物效價。第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢菌素族青霉素族一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)*****6-氨基青霉烷酸7-氨基頭孢菌烷酸第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天酸性：青霉素和頭孢菌素分子中的游離羧基具有相當(dāng)強(qiáng)的酸性，大多數(shù)青霉素的pKa在2.5～2.8之間，能與無機(jī)堿或某些有機(jī)堿形成鹽。旋光性：青霉素族分子中含有三個手性碳原子，頭孢菌素族含有兩個手性碳原子，故都具有旋光性。第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天β-內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性：

β-內(nèi)酰胺環(huán)是該類抗生素的結(jié)構(gòu)活性中心，其性質(zhì)活潑，是分子結(jié)構(gòu)中最不穩(wěn)定部分，其穩(wěn)定性與含水量和純度有很大關(guān)系。在酸、堿、青霉素酶、羥胺及某些金屬離子（銅、鉛、汞和銀）或氧化劑等作用下，易發(fā)生水解和分子重排，導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞而失去抗菌活性。第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天二、鑒別試驗(yàn)（一）呈色反應(yīng)羥肟酸鐵反應(yīng)青霉素及頭孢菌素在堿性中與羥胺作用，β-內(nèi)酰胺環(huán)破裂生成羥肟酸；在稀酸中與高鐵離子呈色。茚三酮反應(yīng)（側(cè)鏈含

-氨基酸結(jié)構(gòu)）與重氮苯磺酸的偶合反應(yīng)（側(cè)鏈含酚羥基）硫酸-甲醛試驗(yàn)第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（二）各種鹽的反應(yīng)鉀、鈉離子的火焰反應(yīng)有機(jī)胺鹽的特殊反應(yīng)（如普魯卡因青霉素的重氮化-偶合反應(yīng)）（三）色譜法高效液相色譜法（HPLC）薄層色譜法（TLC）中國藥典收載的頭孢菌素族藥物和大多數(shù)青霉素族藥物采用HPLC法進(jìn)行鑒別。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天（四）光譜法IR——各國藥典對收載的β-內(nèi)酰胺類抗生素幾乎均采用了本法進(jìn)行鑒別。該類抗生素共有的特征峰：

－內(nèi)酰胺環(huán)羰基的伸縮振動（1750～1800）仲酰胺的氨基、羰基的伸縮振動（3300cm-1±，1525cm-1±，1680cm-1±）羧酸離子的伸縮振動（1600cm-1±、1410cm-1±）UV——利用最大吸收波長鑒定法或利用水解產(chǎn)物的最大吸收波長鑒定法。第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天三、特殊雜質(zhì)的檢查本類抗生素的特殊雜質(zhì)主要有高分子聚合物，有關(guān)物質(zhì)，異構(gòu)體等，一般采用HPLC法控制其量，也有采用測定雜質(zhì)的吸收度來控制雜質(zhì)量的。第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天聚合物——HPLC法聚合物的檢查采用分子排阻色譜法。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)修飾凝膠如葡聚糖凝膠（sephadex）和聚丙烯酰胺凝膠（sepharose）等為填充劑。現(xiàn)以頭孢他啶中頭孢他啶聚合物的測定為例第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用葡聚糖凝膠G-10（40～120

m）為填充劑，玻璃柱內(nèi)徑1.3～1.5cm，床體積50～60mL；流動相A為含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（pH值7.0），流動相B為0.01%十二烷基硫酸鈉溶液；流速為每分鐘1mL；檢測波長為254nm。以流動相A為流動相，用1mg/mL藍(lán)色葡聚糖2000溶液進(jìn)樣200

L進(jìn)行測定，理論板數(shù)應(yīng)不低于900，拖尾因子在0.75～1.5，對照品溶液以流動相B為流動相，重復(fù)進(jìn)樣200

L，峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)小于5.0%。排阻分子量在1000左右第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天對照品溶液的制備：取頭孢他啶對照品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶100

g/1mL的溶液，搖勻。測定法：取本品適量，精密稱定，加水制成含頭孢他啶20mg/1mL的溶液，立即進(jìn)樣200

L，以流動相A為流動相進(jìn)行測定，記錄色譜圖；另取對照品溶液200

L注入液相色譜儀，以流動相B為流動相，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算，本品含頭孢他啶聚合物以頭孢他啶計不得過0.3%。第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天自身對照外標(biāo)法的原理：該法是利用特定條件下β-內(nèi)酰胺類抗生素可以締合成與高分子雜質(zhì)有相似色譜行為的締合物，即在Kav=0處表現(xiàn)為單一的色譜峰。以藥物自身為對照品，測定其在特定條件下締合時的峰響應(yīng)指標(biāo)；然后改變色譜條件，測定樣品，記錄樣品色譜圖中Kav=0處的高分子雜質(zhì)峰的響應(yīng)指標(biāo)，按外標(biāo)法計算，即得樣品中高分子雜質(zhì)相當(dāng)于藥品本身的相對含量。Kav=有效分配系數(shù)第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天自身對照液樣品液流動相B——0.01%十二烷基硫酸鈉溶液流動相A——含3.5%硫酸銨的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液締合物高聚物A高聚物﹤A締合物第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體

例1頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：要求頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體之間、頭孢呋辛酯A異構(gòu)體與頭孢呋辛酯△3-異構(gòu)體之間的分離度R﹥1.5。頭孢呋辛酯A，B異構(gòu)體、△3-異構(gòu)體及E異構(gòu)體峰的相對保留時間分別約為1.0、0.9、1.2及1.7和2.1。

異構(gòu)體——供試品色譜圖中A異構(gòu)體峰的面積與A、B異構(gòu)體峰的面積和之比應(yīng)為0.48～0.55。有關(guān)物質(zhì)——按自身對照法測定，E異構(gòu)體不得過1.0%；△3-異構(gòu)體不得過1.5%；其他單個雜質(zhì)不得過0.5%并規(guī)定了總雜質(zhì)量不得過3.0%。

第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天1頭孢呋辛；2異構(gòu)體B；3異構(gòu)體A；4△3-異構(gòu)體；5,6E異構(gòu)體△3-異構(gòu)體是取頭孢呋辛酯對照品經(jīng)加熱破壞處理而制得，E異構(gòu)體經(jīng)紫外光照射24h制得。頭孢呋辛酯是由兩個非對映異構(gòu)體頭孢呋辛酯A和B組成的混合物第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天吸光度如青霉素鈉（鉀）的吸光度檢查：取本品，加水制成每1mL中含1.80mg的溶液，照分光光度法，在280nm的波長處測定吸收度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸收度應(yīng)為0.80～0.88。此法中264nm處吸收值用來控制青霉素鈉（鉀）的含量，280nm處吸收值用來控制雜質(zhì)的量。第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天四、含量測定高效液相色譜法這是β-內(nèi)酰胺類抗生素含量測定的主要方法。中國藥典收載的本類抗生素原料及制劑共約70種，應(yīng)用HPLC法測定含量的有50多種，約占78%。本類藥物的HPLC法通常采用反相HPLC，以外標(biāo)法計算含量。第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)氨基糖苷類抗生素這類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都是以堿性環(huán)已多元醇為苷元，與氨基縮合而成的苷，故稱為氨基糖苷類抗生素。主要有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素及巴龍霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、硫酸依替米星等它們的抗菌譜和化學(xué)性質(zhì)都有共同之處。第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)鏈霉素鏈霉素第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天慶大霉素R1R2R3分子式C1CH3CH3HC21H43N5O7C2CH3HHC20H41N5O7C2aHHCH3C20H41N5O7C1aHHHC19H29N5O7慶大霉素第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天二、鑒別試驗(yàn)茚三酮反應(yīng)——本類抗生素具羥基胺類和α-氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色化合物。N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)——水解，產(chǎn)生葡萄糖胺衍生物，在堿性溶液中與乙酰丙酮縮合成吡咯衍生物，再與對二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反應(yīng)，生成櫻桃紅色縮合物。吡咯衍生物櫻桃紅色縮合物第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天麥芽酚（Maltol）反應(yīng)

在堿性溶液中，鏈霉糖經(jīng)分子重排、擴(kuò)環(huán)、消除反應(yīng)，生成麥芽酚，與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。麥芽酚紫紅色為鏈霉素的專屬反應(yīng)第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天坂口（Sakaguchi）反應(yīng)——鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍與8-羥基喹啉、次溴酸鈉反應(yīng)，生成橙紅色化合物。為鏈霉素的專屬反應(yīng)第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天三、特殊雜質(zhì)檢查及組分分析1、鏈霉素中鏈霉素B的檢查鏈霉素B是指甘露糖鏈霉素，由發(fā)酵產(chǎn)生,其生物活性僅為鏈霉素的20%~25%，能被甘露糖鏈霉素B苷酶水解成甘露糖和鏈霉素。中國藥典（2005）新規(guī)定了該項(xiàng)檢查，采用薄層色譜法測定。第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天溶液配制供試品溶液：

取本品0.25g，精密稱定，置回流瓶中，加入5ml新鮮配制的硫酸-甲醇溶液（397?

）溶解，加熱回流1h，冷卻，用甲醇沖洗冷凝管，合并沖洗液，并用甲醇定量稀釋成每1ml中含10mg的溶液，作為供試品溶液。對照溶液：

精密稱取甘露糖對照品約36mg，置回流瓶中，同法處理后定量制成每1ml中含72

g的溶液，作為對照溶液。第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天TLC方法薄層板：硅膠G點(diǎn)樣：各10μl，分別點(diǎn)于同一薄層板上展開劑：甲苯-醋酸-甲醇（5025?25?）顯色劑：新鮮配制的1，3-萘二酚與硫酸混合溶液，在110

C加熱數(shù)分鐘顯色。限度：供試品溶液所顯鏈霉素B斑點(diǎn)的顏色與對照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深（3.0%）。L=×100%×100%=3.0%70×4.1310×1000C×4.13S×1000根據(jù)1mg甘露糖相當(dāng)于4.13mg的鏈霉素B，則:限量？第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天2、硫酸奈替米星中有關(guān)物質(zhì)的TLC檢查：供試品溶液：150mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1）1.5mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)品溶液（2）3mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)品溶液（3）1.44mg西索米星/mL，點(diǎn)樣：各2

L，展開劑：二氯甲烷-甲醇-濃氨溶液（4：4：2）顯色：0.2%茚三酮溶液，110℃加熱20min。第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果：供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，其顏色與標(biāo)準(zhǔn)品溶液（3）所顯主斑點(diǎn)相比較，不得更深（1%），其他雜質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1）所顯主斑點(diǎn)相比較，均不得更深（1%），如有一點(diǎn)超過，應(yīng)不深于標(biāo)準(zhǔn)品溶液（2）的主斑點(diǎn)（2%）。

注：奈替米星是由西索米星經(jīng)化學(xué)衍生而成的半合成抗生素，因此在奈替米星成品中有可能殘留西索米星，需進(jìn)行控制。

樣西對1對2

供試品溶液：150mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)液（1）1.5mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)液（2）3mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)液（3）1.44mg西索米星/mL第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3、慶大霉素C組分測定慶大霉素C1、C2、C1a對微生物的活性無明顯差異，但其毒副作用和耐藥性有差異，導(dǎo)致各組分的多少影響產(chǎn)品的效價和臨床療效。因此各國藥典均規(guī)定控制各組分的相對百分含量。慶大霉素?zé)o紫外吸收，當(dāng)采用HPLC-紫外檢測器檢測時，需進(jìn)行衍生化處理。由于其具有強(qiáng)極性和水溶性，為獲得理想的色譜結(jié)果，可采用離子對色譜法，以庚烷磺酸鈉為反離子。第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天如USP（29）利用慶大霉素C組分結(jié)構(gòu)中的氨基與鄰苯二醛（OPA）、巰基醋酸在pH10.4的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)，生成1-烷基-2-烷基硫代異吲哚衍生物，在330nm波長處有強(qiáng)吸收。ChP和BP曾采用USP同樣的方法測定慶大霉素C組分，但在現(xiàn)版藥典中分別改用了蒸發(fā)光散射檢測器和電化學(xué)檢測器。慶大霉素OPA巰基醋酸異吲哚衍生物第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天ChP（2005）采用蒸發(fā)光散射檢測器檢測色譜條件：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（pH值范圍0.8～8.0）；0.2mol/L三氟醋酸-甲醇（92：8）為流動相，流速0.6ml/min；蒸發(fā)光散射檢測器檢測第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天系統(tǒng)適用性試驗(yàn)分別稱取慶大霉素和小諾霉素標(biāo)準(zhǔn)品各適量，用流動相制成每1ml中各含0.2mg的溶液，取20

l注入液相色譜儀，記錄色譜圖.C組分的出峰順序從第二個主峰計，依次為慶大霉素C1a、C2、小諾霉素、C2a、C1；

C2、小諾霉素和C2a峰之間的分離度應(yīng)符合要求；連續(xù)進(jìn)樣的小諾霉素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天測定法取小諾霉素標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，分別用流動相制成每1ml中約含小諾霉素0.2mg、0.5mg和1.0mg的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1）、（2）、（3）。取上述三種溶液各20

l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的對數(shù)值與相應(yīng)的主峰面積對數(shù)值的回歸方程，相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)不小于0.99；lg0.2lg0.5lg1.0lgAr≥0.99第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天另取本品適量，精密稱定，用流動相制成每1ml中約含慶大霉素2.5mg的溶液，同法測定，用回歸方程計算供試品中對應(yīng)各組分的量（Xcx），并根據(jù)所得的各組分的量（Xcx）按下面公式計算出各組分的含量。式中Cx

為慶大霉素各組分的含量；C1應(yīng)為25%～50%，C1a應(yīng)為15%～40%，C2a+C2應(yīng)為20%～50%。第37頁,共43頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)四環(huán)素類抗生素這類抗生素分子有四個環(huán)構(gòu)成，故統(tǒng)稱為四環(huán)素類（tetracyclines）抗生素。一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)：四環(huán)素類抗生素，可以看作四駢苯或萘駢萘的衍生物。第38頁,共43頁，2024年2月25日，星期天性質(zhì)1、酸堿性（具兩性）2、旋光性（有多個手性碳）3、紫外吸收和熒光（剛性平面結(jié)構(gòu)）4、與金屬離子形成配位化合物5、不穩(wěn)定性四環(huán)素類抗生素對各種氧化劑（包括空氣中氧在內(nèi)）、酸、堿都是不穩(wěn)定的，易發(fā)生差向異構(gòu)化、降解等反