DB32T3628-2019木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.080

B13

備案號：

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3628—2019

木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationforproductionofsolidTrichodermaspp.spawn

2019-07-11發(fā)布2019-08-01實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3628—2019

木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)場地要求、生產(chǎn)流程、產(chǎn)品檢測、建立生產(chǎn)檔案、

包裝及貯存運輸要求等技術(shù)環(huán)節(jié)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于木霉固態(tài)菌種的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB3838地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB20287農(nóng)用微生物菌劑

NY/T883農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

固態(tài)菌種solidspawn

生長在固態(tài)培養(yǎng)基料上的菌種。

3.2

微生物接種劑microbialinoculant

一種或一種以上的目的微生物經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)增殖后直接使用，或經(jīng)濃縮或經(jīng)載體吸附而成的活菌制

品。

3.3

固體培養(yǎng)基solidmedium

以富含木質(zhì)纖維素或淀粉類天然物質(zhì)為主要原料，添加適量的有機氮源及無機鹽類，具一定水分含

量的培養(yǎng)基。

4生產(chǎn)場地要求

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DB32/T3628—2019

4.1生產(chǎn)基地選擇

生產(chǎn)基地應(yīng)遠離居住區(qū)、城區(qū)等，并且交通便利，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，周邊植被覆蓋率高。生產(chǎn)地塊集

中連片并位于原料收集區(qū)較近的地方。車間保溫保濕性能良好，同時具備通風(fēng)性能。

4.2生產(chǎn)環(huán)境

廠區(qū)空氣質(zhì)量達到大氣環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3095中II類標(biāo)準(zhǔn)要求。

發(fā)酵用水達到地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3838中III類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水應(yīng)達到標(biāo)準(zhǔn)IV類水質(zhì)要

求。

4.3生產(chǎn)車間

4.3.1原料庫

原料庫要求水電方便，平坦干燥、通風(fēng)良好，光照充足、空曠寬闊，遠離火源，注意防火設(shè)施的建

設(shè)。

4.3.2接種室

接種室必須設(shè)緩沖間，通風(fēng)和保溫性能良好，并具有防塵換氣性能，墻內(nèi)壁和屋頂光滑，必須做好

殺菌消毒工作，確保接種室環(huán)境的相對無菌。

4.3.3培養(yǎng)室

培養(yǎng)室內(nèi)壁和屋頂光滑，便于清洗與消毒，有條件的單位可以建設(shè)半地下室的培養(yǎng)室，或者將培養(yǎng)

室墻壁加厚，有利于培養(yǎng)室的控溫。

4.3.4檢驗室

檢驗室宜留出便于檢驗儀器設(shè)備安裝的場所，同時水電布局要求合理，建立車間環(huán)境衛(wèi)生制度，定

期對生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的。

5生產(chǎn)流程

5.1技術(shù)環(huán)節(jié)

木霉固態(tài)菌種主要包括木霉高密度液體發(fā)酵、固體基質(zhì)準(zhǔn)備、接種木霉液體菌種、固體發(fā)酵的控制、

固態(tài)菌種后處理、產(chǎn)品包裝、質(zhì)量檢測及出廠等技術(shù)環(huán)節(jié)。具體工藝流程見附錄A。

5.2菌種要求

5.2.1原種

原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種有如下要求：

——原種應(yīng)有菌種鑒定報告。

——原種應(yīng)有菌種的企業(yè)編號、來源信息等。

5.2.2菌種保管

采用固體曲保藏和凍干管保藏的方法保藏木霉固體孢子，確保無雜菌污染，菌種不退化。分類純化

并定期檢查，建立菌種檔案。

2

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5.2.3菌種質(zhì)量控制

在進行生產(chǎn)之前，應(yīng)對所使用的菌種進行檢查，并確認其純度和性能沒有發(fā)生退化，如出現(xiàn)污染或

者退化情況，該菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，應(yīng)該按照標(biāo)準(zhǔn)NY/T883執(zhí)行。

5.3液體發(fā)酵增殖

木霉菌種的液體發(fā)酵增殖，按照NY/T883執(zhí)行。具體的培養(yǎng)基見附錄B。

木霉菌絲體采用棉蘭染色法觀察：在載玻片中央滴加一滴無菌水，并將菌絲體均勻分布其中，蓋上

蓋玻片，盡量不留氣泡，從一側(cè)滴加少量的棉蘭染色液染色5min，染色結(jié)束后用無菌水慢慢沖洗染色

液，表面風(fēng)干后在顯微鏡下觀察，染色液配方具體見附錄C。菌絲清晰可見，生長良好，沒有出現(xiàn)雜菌

污染，可以作為菌種繼續(xù)使用；如果菌絲細小并呈不規(guī)則分布或者有雜菌污染，應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)NY/T883處

理。

5.4固體培養(yǎng)基制備

5.4.1培養(yǎng)基要求

發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后木霉菌絲體生長旺盛，在保證有一定的生物量（菌絲體）的前提下兼顧分生

孢子及有效代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

原料要求來源充足、價格合理、營養(yǎng)成分充足，宜采用農(nóng)作物秸稈及農(nóng)用氨基酸作為主要原料。

5.4.2制備過程

5.4.2.1秸稈前處理

以農(nóng)作物秸稈作為發(fā)酵基質(zhì)，使用前晾干（含水率約15%，含有機質(zhì)約65%）并用粉碎機將其粉碎

成0.3cm～0.4cm長的片段。

5.4.2.2氨基酸添加

往上述秸稈中添加氨基酸稀釋液，氨基酸稀釋液的添加量為每100g曬干后的秸稈加入100～200mL

的氨基酸稀釋液（氨基酸原液總氨基酸含量≥10%），調(diào)節(jié)起始pH為3.0～4.0，物料的含水率應(yīng)該嚴格

控制在50%～60%之間，陳化4h～6h后備用。

5.4.3滅菌

5.4.3.1高壓蒸汽滅菌要求

固體發(fā)酵培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121℃～130℃，滅菌時間為1.0h～2.0h；或者采用100℃滅菌2h～

4h，24h后再滅菌一次。

5.4.3.2滅菌效果檢測

將1g固體發(fā)酵產(chǎn)物加入到9mL無菌水中，充分混勻后制成懸液，吸取1mL懸液加入到裝有已滅菌

的9mL營養(yǎng)肉湯的試管中，并做至少三個生物學(xué)重復(fù)，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，24h

內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體后即可判定徹底滅菌，反之則判定為滅菌不徹底，不可用于固體發(fā)酵。

5.5接種

3

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固體發(fā)酵培養(yǎng)基高溫蒸汽滅菌后，待其降至室溫，盡快將滅好菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至固體發(fā)酵

培養(yǎng)室。將發(fā)酵好的木霉菌絲體按5%的接種量（v/w，鮮重）接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基料中并充分拌勻，

分裝到不同的淺盤當(dāng)中，并將塑料淺盤轉(zhuǎn)移到具有控溫控濕功能的發(fā)酵室內(nèi)進行培養(yǎng)。

5.6發(fā)酵控制

5.6.1培養(yǎng)溫度

固體發(fā)酵的溫度應(yīng)該嚴格控制在（28±2）℃，根據(jù)不同木霉發(fā)酵特性和生長代謝特征，適當(dāng)調(diào)整

到最佳的發(fā)酵溫度。

5.6.2物料含水率

固體發(fā)酵初期，最適宜的物料含水率應(yīng)該控制在50%～60%之間，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)品的含水率

應(yīng)該控制在20%～40%之間。

5.6.3空氣濕度

固體發(fā)酵過程中，空氣濕度宜嚴格控制在70%～75%之間。

5.7發(fā)酵終點判斷

5.7.1物理性狀

采用感觀法評價固體發(fā)酵物料的顏色、形態(tài)和氣味。

5.7.2孢子定量

5.7.2.1稀釋涂布

以無菌操作取樣25g轉(zhuǎn)至225mL無菌生理鹽水中，并充分震蕩后制成1：10的菌懸液。并利用梯度

稀釋法進行樣品稀釋，吸取最后的稀釋液0.1mL于木霉選擇性培養(yǎng)基上（見附錄B），并用涂布棒將菌

懸液涂布均勻。

5.7.2.2培養(yǎng)

在28℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)2d～3d，注意觀察菌落的生長情況。

5.7.2.3計數(shù)

——記錄各平板的菌落總數(shù)，求出不同稀釋度平板中的平均菌落數(shù)，計算出每克原始樣品中的菌落

數(shù)。

——固體發(fā)酵產(chǎn)物中有效活菌數(shù)含量≥4.0×109個/克。

6產(chǎn)品檢測

6.1有效活菌數(shù)檢測

按照5.7.2的方法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中的有效活菌數(shù)。

6.2雜菌率檢測

雜菌率的檢測按照GB20287執(zhí)行，木霉固體發(fā)酵產(chǎn)物的雜菌數(shù)應(yīng)≤1.0×104個/克。

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DB32/T3628—2019

6.3其他項目檢測

固體發(fā)酵物的細度、有害元素含量（Hg、Pb、Cd、Cr、As）、pH（5.5～7.5）、大腸桿菌數(shù)、蛔

蟲卵死亡率值達到NY/T883的要求。

7建立生產(chǎn)檔案

每批次生產(chǎn)的產(chǎn)品，必須建立完善的生產(chǎn)檔案，包括產(chǎn)品檢驗項目、檢驗結(jié)果、實驗人、批準(zhǔn)人以

及檢驗日期等準(zhǔn)確信息。

8包裝及貯存運輸要求

8.1包裝

包裝標(biāo)簽按GB/T191規(guī)定執(zhí)行。

8.2貯存

產(chǎn)品應(yīng)貯存于陰涼干燥處，環(huán)境溫度不宜超過30℃，并避免與化肥、農(nóng)藥等一同貯存。

8.3運輸

在運輸過程中應(yīng)注意防潮、防曬、防破裂。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程示意圖

發(fā)酵原種

退化污染

原種復(fù)壯菌種純度檢測及其功能分析原種純化

發(fā)酵過程的

優(yōu)化與控制

液體菌種

的檢測

按規(guī)定處理檢測不合格檢測合格

固體發(fā)酵過程

中發(fā)酵參數(shù)的

優(yōu)化與控制主

要包括pH、

含水率、發(fā)酵

時間等

固體菌種包裝

質(zhì)量檢驗

檢測不合格檢測合格

出廠

按規(guī)定處理

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基及其配方

原種培養(yǎng)基及其配方：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基），其中馬鈴薯200g煮沸后取濾液，

葡萄糖20g，瓊脂25g，水1000mL，pH調(diào)整為5.0。

搖瓶種子培養(yǎng)基及其配方：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，其中馬鈴薯200g煮沸后取濾液，葡萄糖20g，

水1000mL，pH調(diào)整為5.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基及其配方：土豆150kg/T、蔗糖15kg/T、玉米粉5g/T、(NH4)2SO45kg/T、MgSO4·7H2O

0.5kg/T、KH2PO41kg/T、pH自然；pH調(diào)整為5.0。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：農(nóng)作物秸稈（優(yōu)選水稻秸稈和玉米秸稈，含水率約15%，含有機質(zhì)量約65%）晾

干后用粉碎機將其粉碎成0.3cm～0.4cm長的片段；往上述秸稈中添加氨基酸稀釋液，氨基酸稀釋液的

添加量為每100g曬干后的秸稈加入100mL～200mL的氨基酸稀釋液（相當(dāng)于100g曬干后的秸稈中加入

10mL～20mL的氨基酸水解液原液，氨基酸原液中總氨基酸的含量≥10%），調(diào)節(jié)起始pH為3.0～4.0，

初始含水率嚴格控制在50%～60%之間，陳化4h～6h后備用（可以對秸稈進行預(yù)處理，更利于木霉利

用秸稈）。

木霉選擇性培養(yǎng)基：蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，磷酸二氫鉀1.0g/L，硫酸鎂0.5g/L，瓊脂20.0

g/L，孟加拉紅0.033g/L；上述培養(yǎng)基使用前，加入氯霉素0.1g/L，五氯硝基苯（75%可濕性粉劑）0.2g/L，

1%鏈霉素（w/v）9mL，霜霉威0.2g/L。

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附錄C

（規(guī)范性附錄）

染色液及其配方

石炭酸10g，乳酸（比重1.21）10mL，甘油20mL，蒸餾水10mL，棉藍0.02g，將石炭酸加在蒸餾

水中加熱溶解，然后加入乳酸和甘油，最后加入棉藍，使其溶解，放置過夜后，用雙層濾紙過濾置于4℃

冰箱保存。

_________________________________

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DB32/T3628—2019

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：沈其榮、劉東陽、黃啟為、李榮、凌寧。

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DB32/T3628—2019

木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了木霉固態(tài)菌種生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)場地要求、生產(chǎn)流程、產(chǎn)品檢測、建立生產(chǎn)檔案、

包裝及貯存運輸要求等技術(shù)環(huán)節(jié)。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于木霉固態(tài)菌種的生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T191包裝儲運圖示標(biāo)志

GB3095環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB3838地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GB20287農(nóng)用微生物菌劑

NY/T883農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3術(shù)語與定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

固態(tài)菌種solidspawn

生長在固態(tài)培養(yǎng)基料上的菌種。

3.2

微生物接種劑microbialinoculant

一種或一種以上的目的微生物經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)增殖后直接使用，或經(jīng)濃縮或經(jīng)載體吸附而成的活菌制

品。

3.3

固體培養(yǎng)基solidmedium

以富含木質(zhì)纖維素或淀粉類天然物質(zhì)為主要原料，添加適量的有機氮源及無機鹽類，具一定水分含

量的培養(yǎng)基。

4生產(chǎn)場地要求

1

DB32/T3628—2019

4.1生產(chǎn)基地選擇

生產(chǎn)基地應(yīng)遠離居住區(qū)、城區(qū)等，并且交通便利，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，周邊植被覆蓋率高。生產(chǎn)地塊集

中連片并位于原料收集區(qū)較近的地方。車間保溫保濕性能良好，同時具備通風(fēng)性能。

4.2生產(chǎn)環(huán)境

廠區(qū)空氣質(zhì)量達到大氣環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3095中II類標(biāo)準(zhǔn)要求。

發(fā)酵用水達到地表水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB3838中III類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水應(yīng)達到標(biāo)準(zhǔn)IV類水質(zhì)要

求。

4.3生產(chǎn)車間

4.3.1原料庫

原料庫要求水電方便，平坦干燥、通風(fēng)良好，光照充足、空曠寬闊，遠離火源，注意防火設(shè)施的建

設(shè)。

4.3.2接種室

接種室必須設(shè)緩沖間，通風(fēng)和保溫性能良好，并具有防塵換氣性能，墻內(nèi)壁和屋頂光滑，必須做好

殺菌消毒工作，確保接種室環(huán)境的相對無菌。

4.3.3培養(yǎng)室

培養(yǎng)室內(nèi)壁和屋頂光滑，便于清洗與消毒，有條件的單位可以建設(shè)半地下室的培養(yǎng)室，或者將培養(yǎng)

室墻壁加厚，有利于培養(yǎng)室的控溫。

4.3.4檢驗室

檢驗室宜留出便于檢驗儀器設(shè)備安裝的場所，同時水電布局要求合理，建立車間環(huán)境衛(wèi)生制度，定

期對生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的。

5生產(chǎn)流程

5.1技術(shù)環(huán)節(jié)

木霉固態(tài)菌種主要包括木霉高密度液體發(fā)酵、固體基質(zhì)準(zhǔn)備、接種木霉液體菌種、固體發(fā)酵的控制、

固態(tài)菌種后處理、產(chǎn)品包裝、質(zhì)量檢測及出廠等技術(shù)環(huán)節(jié)。具體工藝流程見附錄A。

5.2菌種要求

5.2.1原種

原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種有如下要求：

——原種應(yīng)有菌種鑒定報告。

——原種應(yīng)有菌種的企業(yè)編號、來源信息等。

5.2.2菌種保管

采用固體曲保藏和凍干管保藏的方法保藏木霉固體孢子，確保無雜菌污染，菌種不退化。分類純化

并定期檢查，建立菌種檔案。

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5.2.3菌種質(zhì)量控制

在進行生產(chǎn)之前，應(yīng)對所使用的菌種進行檢查，并確認其純度和性能沒有發(fā)生退化，如出現(xiàn)污染或

者退化情況，該菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，應(yīng)該按照標(biāo)準(zhǔn)NY/T883執(zhí)行。

5.3液體發(fā)酵增殖

木霉菌種的液體發(fā)酵增殖，按照NY/T883執(zhí)行。具體的培養(yǎng)基見附錄B。

木霉菌絲體采用棉蘭染色法觀察：在載玻片中央滴加一滴無菌水，并將菌絲體均勻分布其中，蓋上

蓋玻片，盡量不留氣泡，從一側(cè)滴加少量的棉蘭染色液染色5min，染色結(jié)束后用無菌水慢慢沖洗染色

液，表面風(fēng)干后在顯微鏡下觀察，染色液配方具體見附錄C。菌絲清晰可見，生長良好，沒有出現(xiàn)雜菌

污染，可以作為菌種繼續(xù)使用；如果菌絲細小并呈不規(guī)則分布或者有雜菌污染，應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)NY/T883處

理。

5.4固體培養(yǎng)基制備

5.4.1培養(yǎng)基要求

發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后木霉菌絲體生長旺盛，在保證有一定的生物量（菌絲體）的前提下兼顧分生

孢子及有效代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

原料要求來源充足、價格合理、營養(yǎng)成分充足，宜采用農(nóng)作物秸稈及農(nóng)用氨基酸作為主要原料。

5.4.2制備過程

5.4.2.1秸稈前處理

以農(nóng)作物秸稈作為發(fā)酵基質(zhì)，使用前晾干（含水率約15%，含有機質(zhì)約65%）并用粉碎機將其粉碎

成0.3cm～0.4cm長的片段。

5.4.2.2氨基酸添加

往上述秸稈中添加氨基酸稀釋液，氨基酸稀釋液的添加量為每100g曬干后的秸稈加入100～200mL

的氨基酸稀釋液（氨基酸原液總氨基酸含量≥10%），調(diào)節(jié)起始pH為3.0～4.0，物料的含水率應(yīng)該嚴格

控制在50%～60%之間，陳化4h～6h后備用。

5.4.3滅菌

5.4.3.1高壓蒸汽滅菌要求

固體發(fā)酵培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121℃～130℃，滅菌時間為1.0h～2.0h；或者采用100℃滅菌2h～

4h，24h后再滅菌一次。

5.4.3.2滅菌效果檢測

將1g固體發(fā)酵產(chǎn)物加入到9mL無菌水中，充分混勻后制成懸液，吸取1mL懸液加入到裝有已滅菌

的9mL營養(yǎng)肉湯的試管中，并做至少三個生物學(xué)重復(fù)，將試管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，24h

內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體后即可判定徹底滅菌，反之則判定為滅菌不徹底，不可用于固體發(fā)酵。

5.5接種

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DB32/T3628—2019

固體發(fā)酵培養(yǎng)基高溫蒸汽滅菌后，待其降至室溫，盡快將滅好菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至固體發(fā)酵

培養(yǎng)室。將發(fā)酵好的木霉菌絲體按5%的接種量（v/w