莽草酸脫氫酶（ShikimatedehydrogenaseSD）試劑盒說明書

第第頁莽草酸脫氫酶（Shikimatedehydrogenase，SD）試劑盒說明書莽草酸脫氫酶（Shikimatedehydrogenase，SD）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：莽草酸途徑是存在于植物、真菌和微生物中的一條緊要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸合成途徑中的關(guān)鍵酶。測(cè)定原理：莽草酸脫氫酶催化莽草酸和NADP產(chǎn)生NADPH，檢測(cè)340nm下的吸光值加添速率來表示SD活性。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑構(gòu)成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×2瓶，4℃保管；粗酶液提?。杭?xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測(cè)定（1）在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min，現(xiàn)配現(xiàn)用。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立刻記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和5min20s后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2A1、SD活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=643×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=643×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.286×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=1286×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1286×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。SD（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.572×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；