本科畢業(yè)設(shè)計-食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究

常熟理工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計（論文）關(guān)于食用菌工廠化生產(chǎn)污染菌的研究摘要從杏鮑菇工廠中患病的杏鮑菇上分離到了2個菌株（指定為S1，S2），接種至種包中，產(chǎn)生了同樣的病變。根據(jù)革蘭氏染色和生化檢驗結(jié)果，初步鑒這兩個菌株為假單胞菌屬。進一步對其生理生化特性，分析16SrRNA序列，鑒定S1為Pseudomonasputida，S2為Pseudomonasmarginais。關(guān)鍵詞：生化檢驗杏鮑菇16SrRNA基因PseudomonasputidaPseudomonasmarginaisAbstractInplacesofproductionbacteriawererepeatedlyisolated.Fromtheselesionstwobacterialstrains(designatedS1,S2)vaccinationtothepackages,thenproducethesamekindofillness.ResultsofGramstainandbiochemicaltestspreliminarilyidentifiedtheseisolatesasPseudomonas.Physiologicalandbiochemicalproperties,analysisofthe16SrRNAsequences,identifiedS1asPseudomonasputida.Pseudomonas,andS2asPseudomonasmarginais.KeywordsFlammulinavelutipes.PleurotusEryngii.Pseudomonasputida.Pseudomonasmarginais.16SrRNAgene.目錄TOC\o"1-3"\h\z1.引言 11.1課題研究背景 11.2課題國外研究狀況 11.3常見細(xì)菌病害 21.4課題主要研究內(nèi)容 22.材料與方法 32.1主要儀器和培養(yǎng)基 32.1.1主要儀器 32.1.2主要培養(yǎng)基 32.2病原菌的分離純化 42.3病原菌的形態(tài)觀察及染色 72.4病原菌的生理生化性狀 72.4.1葡萄糖氧化發(fā)酵作用的測定 32.4.2氧化酶 42.4.3色素的產(chǎn)生 42.4.4接觸酶 42.4.5甲基紅試驗（M.R.試驗） 52.4.6乙酰甲基甲醇試驗（V.P.試驗） 52.4.7產(chǎn)生吲哚試驗 52.4.8水解七葉靈 62.4.9明膠水解 62.4.10水解淀粉 62.4.11反硝化作用 72.4.12硝酸鹽還原試驗 72.4.13碳源的利用 82.4.14卵磷脂酶測定 82.4.15精氨酸雙水解反應(yīng) 82.5運動性的檢查 72.616SrDNA序列測定與分析 72.6.1變性 82.6.2PCR擴增 82.6.3測序 82.7抑菌劑的篩選 93．結(jié)果與分析 103.1病原菌的固體培養(yǎng)特征 103.2病原菌的個體形態(tài)特征 113.316SrDNA序列分析 133.3.1菌株S1的16SrDNA序列分析 133.3.2菌株S2的16SrDNA序列分析 143.4病原菌的生理生化性狀 173.4.1菌株S1的生理生化特征 173.4.2菌株S2的生理生化特征 183.5抑菌劑的篩選 20參考文獻(xiàn) 20致謝 211．引言1.1課題研究背景杏鮑菇Pleurotuseryngii日名“雪茸”隸屬于傘菌目(AgaricaIes)，側(cè)耳科(Pleurotaceae)，側(cè)耳屬(Pleurotus)。杏鮑菇以其“香味濃郁似杏仁、味道鮮美如鮑魚一而得名，子實體碩大粗壯、營養(yǎng)豐富、菌柄潔白、菌肉肥厚、質(zhì)地脆嫩，既可保鮮加工，又可與魚、肉等合一烹飪，是近年來中國重點開發(fā)的珍稀菇種之一[1]。近年在杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程中出現(xiàn)了嚴(yán)重的污染菌，有些菇農(nóng)種植的杏鮑菇其污染率超過了50％以上，杏鮑菇生產(chǎn)因污染菌造成的損失達(dá)億元以上。目前在杏鮑菇栽培過程中,一些細(xì)菌性病害已成為生產(chǎn)中的一大障礙,嚴(yán)重時幾乎全部失敗。多年來,我們研究對造成杏鮑菇病害的細(xì)菌對指導(dǎo)食用菌生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實意義,對提高杏鮑菇栽培的產(chǎn)量、質(zhì)量和效益發(fā)揮了很大作用。1.2課題國外研究狀況細(xì)菌性病害的報道最早是1926年，但病原的確定則在30年代初，E.B.Lambert和Bull首先鑒定了蘑菇細(xì)菌性斑點病的病原菌為托拉斯熒光假單孢桿菌。后來美國、法國、丹麥、英國、德國、荷蘭、澳大利亞等國相繼報道，并推廣用漂白粉水溶液進行防治。由于蘑菇細(xì)菌性病害分布廣、危害重，1982年在英墾的溫室作物研究所召開了細(xì)菌性斑點病的國際會議，專門討論蘑菇細(xì)菌性病害問題。此后,有關(guān)細(xì)菌性斑點病的研究向深度和廣度展開。其中英國學(xué)者W.C.Wong和T.F.Preece連續(xù)發(fā)表多篇論文，包括用人工接種方法確定菇蕾表面形成菌落的細(xì)蔭數(shù)量和菇蕾直徑大小與癥狀出現(xiàn)的關(guān)系、多種殺菌劑對病原細(xì)菌的作用及其對子實體的毒害、次氯酸鈉防治細(xì)菌性斑點病的有效濃度等。比利時學(xué)者M．GOOT等人應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對分離到的20多個菌株進行了比較鑒定后分成7個類型。我國除對蘑菇細(xì)菌性病害研究外，還報道了平菇細(xì)菌性褐斑病及細(xì)菌性腐爛病，金針菇細(xì)菌性銹斑病等，防治上通過合理噴水保濕和及時通風(fēng)等措施可有效控制病害的發(fā)生[2]。1.3常見細(xì)菌病害[3]1.3.1細(xì)菌性斑點病,又叫細(xì)菌性褐斑病,主要危害蘑菇和平菇。發(fā)病癥狀局限于菌蓋上,菌蓋初期出現(xiàn)水漬狀小斑點,漸漸變成黃褐色并擴大成小斑,不規(guī)則,凹陷,凹陷處呈棕褐色。濕度大時,凹斑內(nèi)有粘稠的菌液,當(dāng)病斑干后,菌蓋往往開裂。病原該病由托拉斯假單胞桿菌引起。1.3.2細(xì)菌性軟腐病主要危害平菇、金針菇、杏鮑菇[4],極為嚴(yán)重。發(fā)病癥狀初期在菌蓋邊緣出現(xiàn)水漬狀,后期遍及整個菌蓋乃至菌柄,子實體漸變褐,有時菌蓋邊緣向內(nèi)翻卷,整個子實體似水燙傷,逐漸軟腐,很粘,濕度大時,菌蓋上可見乳白色菌濃。病原據(jù)鑒定,細(xì)菌性軟腐病是由一種螢光假單胞桿菌引起。1.3.3干腐病主要危害蘑菇。癥狀染病菇畸形、褐色,典型特征是菌蓋歪斜,菇柄基部稍膨大,但不腐爛,逐漸萎縮、干枯,發(fā)病嚴(yán)重時,菌柄全部變褐色。病菇的另一顯著特點是菌柄基部,均帶有較多的泥團。病原該病由一種假單孢桿菌引起。1.3.4蘑菇細(xì)菌性褐斑病。發(fā)病癥狀發(fā)病的菇體先在菌蓋表面產(chǎn)生褐色斑塊,隨著菇體的生長,褐斑逐漸擴大,深入菌蓋,直至整個子實體全部變褐至黑褐,而萎縮死亡,最后腐爛。病原該病原經(jīng)鑒定為甘藍(lán)黑腐黃單胞桿菌引起。1.4課題主要研究內(nèi)容從杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山正興食用菌有限公司）中污染的生產(chǎn)包分離純化，得到純菌落；查閱資料，做相關(guān)的生理生化實驗；提取相關(guān)基因，測序，比對，鑒定實驗菌的種類；查閱相關(guān)資料，考察不同的抗生素對實驗菌的藥性，找出對該實驗菌的防治措施。2.材料與方法2.1主要儀器和培養(yǎng)基2.1.1主要儀器超凈工作臺光學(xué)顯微鏡細(xì)菌鑒定系統(tǒng)2.1.2主要培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨：牛肉膏3g，NaCl5g，蛋白胨10g，水1000ml,pH7.2-7.42.2病原菌的分離純化取一株病態(tài)（表面突起泛黃，有水珠）的杏鮑菇（10g）置于90mL無菌生理鹽水，振蕩20min，稀釋100倍，涂于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上。培養(yǎng)24h后，挑去出現(xiàn)的單菌落，采用平板劃線分離法，進行病原菌的分離純化，純化培養(yǎng)菌株2個，分別記為：S1、S2。將菌株保存在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上備用，使用時轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化。2.3病原菌的形態(tài)觀察及染色將病原菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24h后，觀察牛肉膏蛋白胨平板菌落形態(tài)、牛肉膏蛋白胨斜面菌苔形態(tài)、肉汁凍液體培養(yǎng)基中的生長情況。用革蘭氏染色，芽孢染色，用光學(xué)顯微鏡在油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)[5,6]。2.4病原菌的生理生化性狀參照文獻(xiàn)[5,7,8,9]2.4.1葡萄糖氧化發(fā)酵作用的測定本試驗采用休和利夫森二氏培養(yǎng)基，其配方如下：蛋白胨2g，NaCl5g，K2HPO40.2g，葡萄糖10g，蒸餾水1000ml，1％溴麝香草酚藍(lán)水溶液3ml，pH7.0-7.4用接種環(huán)挑取少量菌種于試管中培養(yǎng)24-48h。與空白管對照比較，如培養(yǎng)基顏色保持原有顏色，則表示該菌不能利用某種糖；如培養(yǎng)基變黃色，則表明該菌能分解某種糖產(chǎn)酸；如如培養(yǎng)基變黃色而且杜氏小管內(nèi)有氣泡，表示該菌能分解糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。2.4.2氧化酶直接在菌苔上滴加鹽酸二甲基對苯二胺(或鹽酸對氨基二甲基苯胺)1％水溶液，不可過濕。在10秒鐘內(nèi)涂抹的菌苔現(xiàn)紅色者為陽性，10-50s現(xiàn)紅色者為延遲反應(yīng)，60s以上現(xiàn)紅色者不計，按陰性處理。2.4.3色素的產(chǎn)生修改金氏(King)等培養(yǎng)基配方如下：金氏等A培養(yǎng)基金氏等B培養(yǎng)基蛋白胨2g2gK2SO41g―甘油1g1gMgCl20.14g―K2HPO4―0.15gMgSO4?7H20―0.15g瓊脂2g2g蒸餾水100ml100ml調(diào)PH為7.2，用新鮮菌種按種上述兩種培養(yǎng)基上，于28-30℃培養(yǎng)1、2、3、5、7、14d觀察。在普通光下檢查非熒光色素，在紫外光下檢查熒光色素。2.4.4接觸酶將測定菌按種于適宜的斜面上，適溫培養(yǎng)18-24h取一環(huán)培養(yǎng)18-24h的菌苗涂于于凈的載破片上，然后滴上一滴3-10％的過氧化氫，若有氣泡(氧氣)，則為接觸酶陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)。2.4.5甲基紅試驗（M.R.試驗）培養(yǎng)基：:蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，水1000ml，每管分裝4-5ml接種試驗菌于以上培養(yǎng)液中，每次二個重復(fù)，置適溫培養(yǎng)2、4、5d(如為陰性可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間)。腸桿菌科的菌要求在37℃培養(yǎng)4d檢查。在培養(yǎng)液中加入一滴甲基紅試劑，紅色為甲基紅試驗陽性反應(yīng)，黃色為陰性反應(yīng)(因甲基紅變色范圍4.4紅-6.0黃)。2.4.6乙酰甲基甲醇試驗（V.P.試驗）培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO45g，水1000ml，pH7.0-7.4，每管分裝4-5ml接種試驗菌于以上培養(yǎng)液中，每次2個重復(fù)，置適溫培養(yǎng)2d．6d。取培養(yǎng)液和40％NaOH等量相混，加少許肌酸，l0min如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為試驗陽性反應(yīng)，有時需要放置更長時間才出現(xiàn)紅色反應(yīng)。可將培養(yǎng)液置48-50℃水浴中處理2h充分搖動，在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽性反應(yīng)。2.4.7產(chǎn)生吲哚試驗培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl5g，水100ml，調(diào)pH7.2-7.4，分裝試管中把新鮮的菌種接種于上述培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)1、2、4、7d的培養(yǎng)液，沿管壁緩緩加入0.5-1毫升的乙醚至培養(yǎng)液，充分震蕩，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時，吲哚可被提取在乙醚層中。濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，乙醚層出現(xiàn)玫瑰紅色，此反應(yīng)為陽性，反之為陰性。2.4.8水解七葉靈培養(yǎng)基：:在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中添加0.1％的七葉靈和0.05％的檸檬酸鐵制成平板取新鮮菌種接種后，適溫培養(yǎng)3、7、14d觀察。產(chǎn)黑褐色色素者為陽性，不產(chǎn)黑褐色素者為陰性。2.4.9明膠水解培養(yǎng)基：蛋白胨5g，明膠100-150g，水1000ml，pH7.2-7.4，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4-5厘米取18-24h的斜面培養(yǎng)物作穿刺接種,并有未接種的空白對照。于20℃溫箱中培養(yǎng)，2、7、10、14和30d在20℃以下的室溫觀察茵的生長情況和明膠是否液化。如菌已生長，明膠表面無凹陷且為穩(wěn)定的凝塊，則為明膠水解陰性。如明膠凝塊部分或全部在20℃以下變?yōu)榭闪鲃拥囊后w，則為明膠水解陽性。如菌已生長，明膠末液化，但明膠表面菌苗下出現(xiàn)凹陷小窩(須與未接種的對照管比較，因培養(yǎng)過久的明膠因水份失散也會凹陷)也是輕度水解，按陽性記錄。若細(xì)菌未生長，則或是不在明膠培養(yǎng)基上生長，或是基礎(chǔ)培養(yǎng)基不適宜。2.4.10水解淀粉培養(yǎng)基：在肉汁陳洋菜培養(yǎng)基中添加0.2％的可溶性淀粉，按倒平板的要求分裝將上列培養(yǎng)基倒成平板，凝固后將培養(yǎng)皿倒置室溫自溫箱中過夜。取新鮮種菌點種，適溫培養(yǎng)。培養(yǎng)2-5d，形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液。平板呈藍(lán)黑，菌落四周圍如不變色或移開菌落后摘加新碘液，菌落下瓊脂仍不變色，表示淀粉水解陽性；如變色則為陰性。2.4.11反硝化作用培養(yǎng)基：肉汁胨培養(yǎng)液100ml，KNO3lg，調(diào)pH7.2-7.4，分裝試管，每管高度約5cm用肉汁胨斜面菌苔為菌種，接種環(huán)接種后用凡士林油封管，同時也要以封油的不含硝酸鉀的培養(yǎng)基做對照。培養(yǎng)1～7d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氨氣，是陽性反應(yīng)；如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也產(chǎn)生氣泡則只能按可疑或陰性處理，不產(chǎn)生氣泡為陰性。2.4.12硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基配方：肉汁胨培養(yǎng)液100ml，KNO3lg，pH7.0-7.6，每管分裝4-5ml試劑：(1)格里斯氏試劑(2)二苯胺試劑將測定菌接種于硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，置適溫培養(yǎng)1、3、5d。每株菌做3個重復(fù)，另留兩管不接種作對照。在兩支干凈的空試管中倒入少許培養(yǎng)1、3、5d的培養(yǎng)液，再各加一滴A液及B液，在對照管中同樣加入A液，B液各一滴。結(jié)果觀察：當(dāng)培養(yǎng)液中滴入A、B液后，溶液如變?yōu)榉奂t色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性。如無紅色出現(xiàn)，則可加入一、二滴二苯胺試劑，此時如呈藍(lán)色反應(yīng)，則表示培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽，又無亞硝酸鹽反應(yīng)，表示無硝酸鹽還原作用：如不呈藍(lán)色反應(yīng)，表示硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其它物質(zhì)，故仍按硝酸鹽還原陽性處理。2.4.13碳源的利用培養(yǎng)基：(NH4)2SO42.0g，NaH2PO4?H2O0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4?7H2O0.2g，CaCl2?2H2O0.1g，蒸餾水1000ml，含碳化合物0.5％，pH6.5±0.1。用菌體懸液，每一個測定菌都須接種未加合碳化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。適溫培養(yǎng)2、5、7、14天觀察。凡測定菌在合有碳水化合物培養(yǎng)基中的生長情況明顯超過空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長情況者為陽性。否則為陰性。如兩種培養(yǎng)基上的生長情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次。如生長差別仍不明顯，則按陰性處理。2.4.14卵磷脂酶測定培養(yǎng)基：無菌條件下取卵黃加等量的生理鹽水，搖勻后，取10ml上述懸液加入到融化的、約50-55℃的200ml牛肉膏蛋白胨中，混合均勻后倒人培養(yǎng)皿內(nèi)。制成的卵黃平板過夜后即可使用。取18-24h的斜面或培養(yǎng)液中的菌體點種在上述平板上。在菌落四周圍和下面有不透明的區(qū)出現(xiàn)，表示卵磷脂分解生成脂肪，說明有卵磷脂酶。2.4.15精氨酸雙水解反應(yīng)培養(yǎng)基：蛋白胨1g，酚紅0.01g，牛肉膏5g，L-精氨酸鹽10g，K2HP040.3g，蒸餾水1000ml，瓊脂6g，pH7.0-7.2，分裝試管，高度約4-5cm。用幼齡菌種穿刺接種，并用凡士林油封管，適溫培養(yǎng)3、7、14天觀察。培養(yǎng)基轉(zhuǎn)為紅色者為陽性，應(yīng)有不含精氨酸空自做對照。2.5運動性的檢查半固體瓊脂穿刺法。用直引穿刺接種試驗菌于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，于適溫培養(yǎng)。細(xì)菌的運動性可用透過光目測。如生良物只生長在穿刺線上，邊緣十分清晰，則表示試驗菌無運動性。如生長物由穿刺線向四周呈云霧狀擴放，其邊緣呈云霧狀，則表示試驗菌株有運動性。對生長快的細(xì)菌應(yīng)培養(yǎng)一天后觀察。如第一第不能判定可在第2—3天再觀察。如2—3天時仍不能明確判定是否有運動性，可延遲到5—6天再觀察一次。因為游動力弱的細(xì)菌，在半固體培養(yǎng)基中第1-2天中尚不能從穿刺線游開，故需多培養(yǎng)幾天觀察。如實驗菌在半固體培養(yǎng)基中產(chǎn)氣，氣泡將穿刺線上的生長物擠亂。此時應(yīng)注意生長物的擴散情況，不可誤將不運動的細(xì)菌判為有運動性。如試驗菌品好癢細(xì)菌．穿刺線上生長物很少，可檢查從培養(yǎng)基表面向下滲入的生長物的情況。2.616SrDNA序列提取及測序委托寶生物工程（大連）有限公司測序2.6.1變性在培養(yǎng)基中挑取菌體于50ulTaKaRaLysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR(CodeNo.D304)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件：80℃，15min2.6.2PCR擴增使用TaKaRa16SrDNABacterialIdentificationPCRKit（CodeNo.D310），進行PCR擴增目的片段。反應(yīng)條件：94℃5min1cycle30cycles72℃5min1cycle反應(yīng)體系:上述1的變性反應(yīng)液1ulPCRPremix25ulForwardprimer(20pmol/ul)0.5ulReverseprimer2(20pmol/ul)0.5ul16S-freeH2O23ulTotal50ul取5ul進行3%瓊脂糖凝膠電泳使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0（CodeNo.D823A）切膠回收目的片段進行DNA測序。2.6.3測序以SeqForward、SeqInternal和SeqReverse為引物進行DNA測序。2.7抑菌劑的篩選2.7.1細(xì)菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定使用細(xì)菌鑒定系統(tǒng)中的藥敏試劑卡對病害菌進行多種抗生素的抑菌實驗。取適量待檢菌株置于藥敏培養(yǎng)液中，用無菌加樣滴管取藥敏試驗菌液加入藥敏試驗孔中，每孔加試驗菌液150μl。蓋上卡片蓋板，將卡片置于35℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-24h后，取出卡片，即可人工目測結(jié)果。2.7.2常用抗生素抗性試驗采用濾紙片法，以抑菌圈的大小，測定殺菌效果。本試驗采用紙碟法：取0.2ml用平板涂布法將菌混勻密布于生長培養(yǎng)基的平板，同時以無菌鑷子取含抗生素的紙片于含菌平板上，置30"℃培養(yǎng)24-48h后，取出觀察抑菌圈大小。讀取結(jié)果，以所測抑菌圈的平均直徑(mm)來表示藥劑對細(xì)菌的抑菌力。(0-5mm)無作用，(6-15mm)弱作用，(>15mm)強抑制作用[14]。3．結(jié)果與分析3.1污染杏鮑菇樣本的性狀描述圖1菌絲包和菇體樣本污染圖Fig.1Thesamplefigureofpollutionduringmycelialandfruitingbodiesgrowth從圖1可以看出，污染杏鮑菇的樣本在菌絲生長階段，在料袋上出現(xiàn)零星的黃色水珠，黏度不大，這一現(xiàn)象導(dǎo)致菌絲長滿袋的時間延長5-7d；且這現(xiàn)象一般出現(xiàn)在袋口附近，緩慢向下蔓延至整個料包的1/4為止。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的料包在菌絲長滿之后進入出菇環(huán)節(jié)，經(jīng)過正常的消毒環(huán)節(jié)后，會長出子實體，但隨著子實體的增大，菇體會出現(xiàn)大量黃色粘稠狀水珠，隨著培養(yǎng)時間的延長，被污染的菇體最終會腐爛，而與之接觸的健康菇體也會被感染出現(xiàn)相同的癥狀。在菌絲生長階段，若在無菌條件下去除黃色水珠，會大幅度降低后期菇體的污染情況以及推遲出現(xiàn)黃色粘稠液體的時間。因此斷定，菌絲生長階段出現(xiàn)的黃色水珠與后期在子實體上的黃色液體為同一菌株的胞外分泌物。3.2污染病原菌的分離分別挑去菌絲料包上的水珠和污染菇體，進行涂布培養(yǎng)。結(jié)果表明，兩個樣本的培養(yǎng)結(jié)果類似，均出現(xiàn)了兩種細(xì)菌，證實了這一污染現(xiàn)象是由兩種微生物引起，分別為CTE722-B和CTE722-C；只是兩者比例有差異，前者CTE722-C較多，CTE722-B較少，后者則反之。在培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，CTE722-B為半透明、淡黃色的圓形菌落，表面隆起，邊緣略粗糙；CTE722-C為半透明、乳白色的圓形菌落，邊緣整齊光滑；CTE722-B的菌落直徑較CTE722-C的大。CTE722-BCTE722-CTE722-BCTE722-C圖2涂布培養(yǎng)結(jié)果Fig.2Theresultofpollutedsamplecoatedculture病原菌的固體培養(yǎng)特征2個菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生長24h后，觀察其形態(tài)特征見表3.1表3.1菌株S1、S2在4種固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征比較培養(yǎng)基菌株S1S2營養(yǎng)瓊脂菌落圓形，半透明，乳白色，表面多皺，隆起，邊緣略粗糙菌落圓形，半透明，乳白色，邊緣整齊，光滑發(fā)亮LB瓊脂菌落圓形，半透明，杏仁白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整菌落圓形，半透明，乳白色，表面光滑濕潤，平坦，邊緣平整金氏等A培養(yǎng)基無水溶性產(chǎn)生無水溶性產(chǎn)生金氏等B培養(yǎng)基無非水溶性色素產(chǎn)生無非水溶性色素產(chǎn)生3.2病原菌的個體形態(tài)特征通過普通光學(xué)顯微鏡對菌株S1、S2的菌體形態(tài)進行觀察，結(jié)果（見表3.2、圖3.1、圖3.2、圖3.3）表3.2菌株S1、S2個體形態(tài)的比較染色方法菌株S1S2革蘭氏染色革蘭氏陰性，短桿狀革蘭氏陰性，短桿狀，近似球狀芽孢染色無芽孢無芽孢圖3.3菌株S1的芽孢染色結(jié)果3.316SrDNA序列分析為進一步確定菌株的分類位置，對其16SrDNA序列進行了分析，結(jié)果見表下表3.3.1菌株S1的16SrDNA序列分析表3.3菌株S1的16SrDNA序列ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAAGAGCTT50GCTCTTCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTG100GTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTA150CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGG200TCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTA250ACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA300CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTG350ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT400TAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTAC450CGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAG500AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGG550TTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCC600AAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAG650CGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCAC700CTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT750TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAA800TCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGG850AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA900GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGG950CCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACT1000CTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG1050GTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTA1100TGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGG1150ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTAC1200AATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACA1250AAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCG1300GAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGG1350CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAG1400CTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGG1450結(jié)果：根據(jù)以上各個結(jié)果，得出：S1菌株為假單胞菌屬3.3.2菌株S2的16SrDNA序列分析表3.4菌株S1的鑒定結(jié)果AccessionDescriptionMaxscoreTotalscoreQuerycoverageEvalueMaxidentHQ218609.1UnculturedbacteriumcloneN-16716SribosomalRNAgene,partialsequencePseudomonassp.BSw10041N16SribosomalRNA,partialsequence26802680100%0.0100%FJ416144.1>gb|JF345181.1|Pseudomonassp.PG1216SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%EU807744.1Pseudomonassp.WMQ-716SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%DQ088809.1UnculturedbacteriumcloneMP104-0916-b4016SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%DQ366089.1UnculturedPseudomonassp.cloneSQ9_Pitesti16SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%AB109776.1Pseudomonasputidagenefor16SrRNA,partialsequence,strain:KF71526802680100%0.0100%AB680572.1Pseudomonasputidagenefor16SrRNA,partialsequence,strain:NBRC1416426762676100%0.099%AB240201.1Pseudomonassp.OCR2genefor16SrRNA,partialsequence26762676100%0.099%AF094736.1PseudomonasputidastrainATCC1263316SribosomalRNAgene,partialsequence26762676100%0.099%HQ218451.1UnculturedbacteriumcloneN-0716SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%EU341207.1UnculturedPseudomonassp.cloneAV_5N-G0316SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%AY344806.1Pseudomonassp.WSCIII16SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%AF094745.1PseudomonasputidastrainATCC1117216SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%JN229867.1Unculturedbacteriumclone1H3C_2216SribosomalRNAgene,partialsequence26692669100%0.099%HM755541.1Pseudomonassp.C-S-NA616SribosomalRNAgene,partialsequence26692669100%0.099%HQ218605.1UnculturedbacteriumcloneN-16316SribosomalRNAgene,partialsequence26692669100%0.099%表3.5菌株S2的16SrDNA序列ACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTT50GCTTCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTG100GTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTA150CGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGG200TCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTA250ACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGA300CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTG350ATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTT400TAAGTTGGGAGGAAGGGTTGTAGATTAATACTCTGCAATTTTGACGTTAC450CGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAG500AGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGG550TTTGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTC600AAAACTGACTGACTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAG650CGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCAC700CTGGACTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT750TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAA800GCCTTGAGCTTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGG850AGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAA900GCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGG950CCTTGACATCCAATGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACA1000TTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG1050GTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAA1100TGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGG1150ATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTAC1200AATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATA1250AAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCG1300GAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGG1350CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTA1400GCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGG1450G1500表3.6菌株S2的鑒定結(jié)果AccessionDescriptionMaxscoreTotalscoreQuerycoverageEvalueMaxidentAB685670.1Pseudomonassp.JCM5463genefor16SribosomalRNA,partialsequence26802680100%0.0100%GQ417869.1UnculturedPseudomonassp.cloneF3Boct.1316SribosomalRNAgene,partialsequence>gb|GQ417872.1|UnculturedPseudomonassp.cloneF3Boct.1616SribosomalRNAgene,partialsequence>gb|GQ417892.1|UnculturedPseudomonassp.cloneF3Boct.3616SribosomalRNAgene,partialsequence>gb|GQ417893.1|UnculturedPseudomonassp.cloneF3Boct.3716SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%GQ417867.1UnculturedPseudomonassp.cloneF3Boct.1116SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%EU681012.1Pseudomonassp.W15Feb2916SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%EU680983.1Pseudomonassp.W15Feb516SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%EU595584.1Pseudomonassp.LC0716SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%AB334527.1Pseudomonassp.MPU101genefor16SribosomalRNA,partialsequence26802680100%0.0100%AM403527.1Pseudomonassp.EP2516SrRNAgene26802680100%0.0100%AM398216.1Pseudomonassp.EP07partial16SrRNAgene,strainEP0726802680100%0.0100%DQ490312.1PseudomonadaceaebacteriumKVD-1700-1816SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%DQ490314.1PseudomonadaceaebacteriumKVD-1700-2316SribosomalRNAgene,partialsequence>gb|DQ490315.1|PseudomonadaceaebacteriumKVD-1700-2516SribosomalRNAgene,partialsequence>gb|DQ490316.1|PseudomonadaceaebacteriumKVD-1700-2616SribosomalRNAgene,partialsequence26802680100%0.0100%AB685618.1Pseudomonassp.JCM5405genefor16SribosomalRNA,partialsequence26762676100%0.099%FN553609.1Unculturedsedimentbacterium16SrRNAgene,clone285-2626762676100%0.099%AB680980.1Pseudomonasfluorescensgenefor16SrRNA,partialsequence,strain:NBRC1584126752675100%0.099%JF766689.1Pseudomonassp.BIHB131216SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%GU198127.1PseudomonasfluorescensstrainLMG1467716SribosomalRNAgene,partialsequence26752675100%0.099%結(jié)果：根據(jù)以上各個結(jié)果，得出：S1菌株為假單胞菌屬3.4病原菌的生理生化性狀3.4.1菌株S1的生理生化特征常規(guī)生理生化測試表明，菌株S1氧化利用葡萄糖，不能發(fā)酵葡萄糖乙醇產(chǎn)酸，接觸酶為陽性，氧化酶為陰性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》[7,9]，斷定菌株S1為假單胞菌屬的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進行了其他生理生化試驗，并和Pseudomonas的細(xì)菌進行比較，結(jié)果見表表3.7菌株S1生理生化測定結(jié)果實驗項目S1P.putidaH262P.putidabiovarA氧化分解葡萄糖+++氧化酶-++接觸酶+++乙醇氧化-/-產(chǎn)生吲哚試驗還原硝酸鹽反應(yīng)+++反硝化作用明膠液化-/-淀粉水解-精氨酸雙水解酶+++乙酰甲基甲醇試驗（V.P.試驗）甲基紅試驗（M.R.試驗）硫化氫產(chǎn)生水解七葉靈-//厭氧生長--d卵磷脂酶測定碳源的利用D-葡萄糖+++D-蔗糖+//D-甘露醇棉子糖+++L-丙氨酸+//生長溫度41℃4℃+++注：+表示反應(yīng)為陽性；-表示反應(yīng)為陰性；d表示11-89菌株為陽性；/表示沒有數(shù)據(jù)報道從表中可以看出，菌株S1生理生化實驗結(jié)果和惡臭假單胞菌(P.putida）基本一致，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色、運動狀態(tài)、16SrDNA等情況，斷定菌株S1為一株惡臭假單胞菌(P.putida）。3.4.2菌株S2的生理生化特征常規(guī)生理生化測試表明，菌株S2氧化利用葡萄糖，不能發(fā)酵葡萄糖乙醇產(chǎn)酸，接觸酶和氧化酶均為陽性。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊第八版》和《常見細(xì)菌鑒定手冊》[7,9]，斷定菌株S1為假單胞菌屬的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊對假單胞菌的鑒定方法，進行了其他生理生化試驗，并和Pseudomonas的細(xì)菌進行比較，結(jié)果見表表3.8菌株S2的生理生化測定結(jié)果實驗項目S2P.marginaispv.marginalisP.marginaispv.pastinacae氧化分解葡萄糖+//氧化酶+++接觸酶+++精氨酸雙水解酶+++還原硝酸鹽反應(yīng)+++明膠液化+++乙醇氧化-//碳源的利用D-葡萄糖+++D-蔗糖+++D-甘露醇棉子糖-++L-丙氨酸+//生長溫度41℃+++4℃產(chǎn)生吲哚試驗-//反硝化作用-//淀粉水解-//乙酰甲基甲醇試驗（V.P.試驗）-//甲基紅試驗（M.R.試驗）-//硫化氫產(chǎn)生-//水解七葉靈-//厭氧生長-//卵磷脂酶測定-//注：+表示反應(yīng)為陽性；-表示反應(yīng)為陰性；d表示11-89菌株為陽性；/表示沒有數(shù)據(jù)報道從表中可以看出，菌株S2生理生化實驗結(jié)果和邊緣假單胞菌(P.marginais）基本一致，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色、運動狀態(tài)、16SrDNA等情況，斷定菌株S2為一株邊緣假單胞菌(P.marginais）。3.5抑菌劑的篩選3.5.1細(xì)菌鑒定系統(tǒng)試劑卡藥敏鑒定根據(jù)菌種的個別生理生化特征選擇了相應(yīng)的試劑卡：S1使用的是腸桿菌科試劑卡，S2使用的是奈瑟菌/嗜血桿菌科試劑卡。結(jié)果見表3.9、3.10。表3.9不同藥劑對S1的抑菌效果抗生素結(jié)果濃度U氨芐西林耐藥≥64氨芐西林/舒巴坦耐藥≥64/32氨曲南敏感≤4頭孢哌酮敏感≤8頭孢噻肟中敏16頭孢他啶敏感≤4頭孢呋肟耐藥≥64頭孢噻吩耐藥≥64頭孢吡肟敏感≤4磷霉素耐藥≥512慶大霉素敏感≤2左氟沙星敏感≤1美洛培南敏感≤2美洛西林敏感≤8呋喃妥因耐藥≥256哌拉西林/他唑巴坦敏感≤8/4復(fù)方新諾明耐藥≥16/304阿米卡星敏感≤8頭孢曲松敏感≤4表3.10不同藥劑對S21的抑菌效果抗生素結(jié)果濃度U強力霉素敏感≤2青霉素耐藥≥4壯觀霉素耐藥≥256頭孢噻肟耐藥≥8頭孢曲松耐藥≥8頭孢他啶耐藥≥8頭孢呋肟耐藥≥2洛美沙星中敏≥0.24氧