毒理學基礎實驗指導

衛(wèi)生毒理學

實驗指導

編寫：秉符古雅

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2009年3月

實驗一毒理學實驗設計..........................................................1

實驗二實驗動物的一般操作技術................................................10

實驗三滅多威經(jīng)口急性毒性試驗................................................20

實驗四笨經(jīng)呼吸道急性毒性試驗................................................24

實險五蓄積毒性試驗...........................................................27

實驗六亞慢性和慢性毒性試驗..................................................29

實驗七小鼠骨微細胞微核試驗..................................................33

實驗八小鼠精子畸形試驗.......................................................37

實驗九骨髓細胞染色體畸變分析................................................40

實驗十鼠傷寒沙門菌回復突變試驗..............................................42

實驗十一致畸試驗及胚胎胎仔檢查方法..........................................47

實驗十二網(wǎng)織紅細胞計數(shù).......................................................53

附錄：動物實驗報告的撰寫及注意事項..........................................54

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實驗一毒理學實驗設計

一'目的和意義

毒理學的很多研究工作需要通過動物實驗來進行。使用實會動物進行科研的優(yōu)點是花費人力、

物力較少，時間短，易發(fā)現(xiàn)單因素與結(jié)果的關系，能提供大量有價值的可與人類生命活動現(xiàn)象相類

比的資料。在毒理學實驗研究中，健康的實驗動物是保證工作順利進行和獲得正確可隼的研究結(jié)果

的重要條件。

毒理學研究外源化學物對于機體（特別是人體）的有害作用及其機制。毒理學研究的主要手段

是動物實驗。體試驗是以實驗動物為模型，最終目的是通過外源化學物對實驗動物的毒性反應，向

人（原型）外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。體外實驗主要用于篩選和預測急性毒

性和機制研究；人體實驗和流行病學調(diào)查則可進一步深化和證實在動物實驗中所得到的資料。實際

上，毒理學作為一門實驗科學是以動物實驗為中心的，毒理學動物實驗的設計'實施、結(jié)果觀察和

評價是毒理學研究的基本方法。

通過本次討論，要求學生基本掌握毒理學實驗設計的原則和方法。

二、容

（-）毒理學實驗的原則和局限性

1、毒理學實驗的原則

在毒理學的試驗中，有三個基本的原則。

第一個原則，化學物在實瞼動物產(chǎn)生的作用，可以外推于人。

第二個原則，實驗動物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對人潛在危害的必需的和可隼的方法。

第三個原則，成年健康（雄性和雌性未孕）的實驗動物和人可能的暴露途徑是基本的選擇。

2、毒理學實驗的局限性

用實驗動物的毒理學實驗資料外推到人群接觸的安全性時，會有很大的不確定性。

（-）毒理學常規(guī)毒性試驗的基本目的

毒性評價或安全性評價方面的基本目的包括以下幾點：

1.受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)。

2.劑量-反應（效應）研究。

3.確定毒作用的靶器官。

4.確定損害的可逆性。

毒理學研究還可能有其他的目的和要求，例如毒作用的敏感檢測指標和生物學標志、毒作用機

制研究、受試物的毒物動力學和代研究、中毒的解救措施等。對這些要求，應擴展常規(guī)試驗的設計

以包括有關的項目，或者另外設計和進行耙器官毒理學研究及機制毒理學研究。

（三）實驗動物的選擇

毒理學的動物實驗是以實瞼動物作為研究對象的，為獲得可靠的研究結(jié)果，先決條件是正確地

選用實驗動物。

1、實驗動物物種的選擇

對實驗動物物種選擇的基本原則是：選擇對受試物在代、生物化學和毒理學特征與人最接近的

物種；自然壽命不太長的物種；易于飼養(yǎng)和實驗操作的物種；經(jīng)濟并易于獲得的物種。

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在毒理學研究中常用的實驗動物物種如下：大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實

驗動物有地鼠、物;猴、小型豬、雞等。常用實驗動物生物學和生理學參數(shù)見表17。

以上實驗動物各物種中，實際上沒有一種完全符合上述物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇物種

的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類，另一種是非嚙齒類。系統(tǒng)毒性研究最常用的嚙齒類是大

鼠和小鼠，非嚙齒類是狗。豚鼠常用于皮膚刺激試驗和致敏試驗，兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺

激試驗。遺傳毒理學試驗多用小鼠，致癌試驗常用大鼠和小鼠，致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔。

遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗常用母雞。

表1T常用實驗動物生物學和生理學參數(shù)

參ft俄狗貓兔大鼠小鼠豚鼠

成體儂型（kg）3.514.03.33.70.450.0350.130.12

161514631.531

水消耗31/力45035032030035614530

飼料消耗（成本1504001001801051210

g/d)

成體代(cal/kgd)1588080110130600100250

體漆CO38.838.938.63914381237.438.638.0

呼吸然率50202553851609083

(次/min)(40-60)(10-30)(20-30)(10-65)(65-110)(80-240)(70-100)(35-130)

心率（次/min）200100120200328600300450

jh壓mmllg159/127148/100155/100110/80130/90120/7577/50108/77

（收縮/舒）

出生體重（g）500-7001100-22001251005-61.575-1002.0

斷孔時體重依）410058003000100-150040-50107225035

開眼。）出生當天8-128-121010-1211出生當天15

妊娠Q）16863633121206716

性周期（d）282215s2815-164s54-516-194

動情期（d）1-27739-19301111

穹的量13-61~61-136-91-121-5172

新禮年齡（周）16-2466-983s4323s4

生殖年齡（月）549106s72~3232

生殖期（年）10-1557041~31131

生殖季節(jié)任何時間春，秋待27個月任何時間任何時間任何時間任何時間任何時間

所帶面積（tf2）今68330.40.40.70.34

環(huán)境流度co18s2818s2818s2818s2819-2519s2519-2519-25

血容量（ML/Kg）7579605365807585

凝血時間（s）90180120300601460113

HCT（%紅的勝》4245404246414250

Hb(g/bl)12.516.011.813.614.816.012.412.0

2、實驗動物品系的選擇

品系（strain）是實險動物學的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一

群動物。

實驗動物按遺傳學控制分類可分為：

①近交系：指全同胞兄妹或親子之間連續(xù)交配20代以上而培育的純品系動物。如小鼠有津白

I、津白II、615,DBA/I和DBA/2,津LB/C,C3H,C57B/6J,A'PA/He'

②雜交群動物（雜交1代，F(xiàn)1），指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產(chǎn)生的第一代

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動物。

③封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交

配繁殖的動物群。如種小鼠、NIH小鼠、LACA小鼠、F344大鼠、Wistar大鼠、SD（Sprague-Dau1

ey）大鼠等。

根據(jù)實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。不同品系實驗動物

對外源化學物毒性反應有差別，所以毒理學研究要選擇適宜的品系，對某種外源化學物毒理學系列

研究中應固定使用同一品系動物，以求研究結(jié)果的穩(wěn)定性。

遺傳毒理學一般利用嚙齒類動物，主要是小鼠或大鼠。如果有合適的理由，其他物種也可接受。

有的文獻報告在小鼠骨髓微核試驗MS/Ae品系比ddy,CDT或BDF品系更頷感。但一般認為還沒能證

明某一品系對所有的遺傳毒性物質(zhì)比其他品系都敏感。在致癌試驗中對實驗動物的品系有一定的要

求，特別重視有關病理損害的自發(fā)發(fā)生率。

3、對實驗動物微生物控制的選擇

按微生物控制分類，實驗動物分為四級，見表1-2。對于毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用

二級（或二級以上）的動物，以保證實驗結(jié)果的可靠性。

表1-2實驗動物微生物等級

級別要求

?77,普通動物，應沒有傳染給人的疾病

II級清潔動物，除I級標準外，種系清楚，沒有該動物特有的疾病

in級無特定病原體動物（SPF），除n級標準外，動物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，

在隔離器或?qū)恿魇绎曫B(yǎng)，可有不致病細菌叢，沒有致病病原體

IV級無菌動物，在全封閉無菌條件下飼養(yǎng)的純系動物，動物體外不帶有任何微生物和寄生蟲（包括絕大部分病

毒）

4、個體選擇

實瞼動物對外來化學物的毒性反應還存在個體差異，應注意實驗動物的個體選擇。

（1）.性別同一物種、同一品系的實驗動物雌雄兩性通常對相同外源化學物毒性反應類似但

雌雄兩性對化學物的毒性敏感性上存在著差別。

如果已知不同性別的動物對受試物敏感性不同，應選擇敏感的性別。如對性別差異不清楚，則

應選用雌雄兩種性別。如實驗中發(fā)現(xiàn)存在性別差異，則應將不同性別動物的實瞼結(jié)果分別統(tǒng)計分析。

在遺傳毒理學體試驗中，對性別的選擇有幾種意見：

①對單個物種應用兩種性別。

②對單個物種應用兩種性別，除非已在一個性別得到陽性反應，就不必對另一種性別進行試驗。

③對單個物種應用兩種性別，除非經(jīng)毒代動力學研究證明受試物（和其代產(chǎn)物）在雄性和雌性

無差別和/或如果在確定劑量的預試驗證明有相等毒性。此假定在非遺傳毒性與遺傳毒性之間有相

關。

④對單個物種常規(guī)用一種性別（雄性或雌性），除非預期/證明存在性別差異。由于歷史的原因

UDS體/體外試驗常規(guī)用雄性大鼠。

一般來說，對于初次試驗的受試物，應該采用兩種性別。對大鼠和小鼠各一種性別進行試驗可

能比單個物種兩種性別提供更好的危害鑒定，但這需要更多的資料來證明。

（2）.年齡和體重

（3）.生理狀態(tài)

（4）.健康狀況

（四）毒理學試驗設計要點

1、體試驗設計

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1）.劑量分組在毒理學試驗中，最重要的就是研究劑量-反應（效應）關系，也就是當外源

化學物染毒劑量增加，實驗動物的毒性反應（效應）隨之而增強。劑量-反應（效應）關系的存在

是確定外源化學物與有害作用的因果關系的重要依據(jù)，也可證明實驗結(jié)果的可靠性。因此，在毒理

學試驗中，一般至少要設3個劑量組（即高劑量組、中劑量組、低劑量組），希望能得到滿意的劑

量-反應（效應）關系。

特別注意設立對照組：

①未處理對照組（以前有稱為空白對照組）：

②陰性（溶劑/賊形劑）對照：

③陽性對照：

④歷史性對照：

2）.各組動物數(shù)

3）.試驗期限

2、體外試驗設計

1）.測定受試物溶解性

2）.試驗最高劑量的推薦

3）.代活化

4）.陽性對照

5）.重復

（五）實驗動物的染毒和處置

1、動物實驗前的準備

2、受試物和樣品的準備

3、染毒途徑

4、實驗動物處死及生物標本采集

1）.實驗動物處死方法

2）.血液采集

3）.尿液采集

4）.病理解剖、標本留取和組織病理學檢查

（六）實驗結(jié)果處理和分析

在毒理學試臉的設計和實施中應貫徹實驗設計的對照、隨機和重復的原則，實驗的各劑量組所

得到的結(jié)果應與陰性對照組比較。根據(jù)實驗結(jié)果（指標）的變量類型是數(shù)值變量（計量資料）還是

分類變量（計數(shù)資料），選用不同的統(tǒng)計分析方法。

在評價毒理學試驗的結(jié)果時，應綜合考慮生物學意義和統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計檢驗的假設是關于總

體特征的假設，檢瞼方法是以統(tǒng)計量的抽樣分布為根據(jù)的，得到的結(jié)論是概率性的，不是絕對的肯

定或否定，不等同于有或無生物學意義。對實驗結(jié)果作出科學的判斷和解釋，應該根據(jù)統(tǒng)計學分析

的結(jié)果、生物學知識和經(jīng)驗。

1、毒理學試驗的統(tǒng)計學

統(tǒng)計學觀點及方法在毒理學試驗的設計和結(jié)果評價中起關鍵的作用，毒理學試驗的發(fā)展也促進

了生物統(tǒng)計學的發(fā)展。毒理學試驗統(tǒng)計學評價的主要進展是劑量一反應關系研究和對超離差數(shù)據(jù)的

統(tǒng)計。

1）.毒理學試瞼設計的統(tǒng)計學要求毒理學試驗的設計應遵循隨機、重復及對照三個原貝I],要求各

觀察值具有代表性，并且是相互獨立的。毒理學試驗的設計具體涉及到劑量水平數(shù)目及間隔，每個

劑量點的實驗單位數(shù)，每個實瞼單位接種及計數(shù)的細胞數(shù)，對照組的設置等。實驗單位的確定對于

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樣品的獨立性是很重要的，實驗單位(experimentalunit)是進行處理時或觀察時獨立的最大采樣單

位。以動物和培養(yǎng)物作為實驗單位要比以細胞作為實驗單位更為可取。此外，如果同時評價幾個不

同因素的效應，應注意均衡的原則，實驗設計應可以區(qū)分不同因素的貢獻并分別估計。

樣本的代表性要求具有同質(zhì)性，即各處理組和對照組的非實驗因素的條件均一致，為此，各實驗

單位(動物或培養(yǎng)物)的分組及整個實驗的全部操作都應遵循隨機化原則。在利用形態(tài)學指標的毒理

學試驗，必須采用盲法觀察結(jié)果，以消除實驗者觀察結(jié)果的偏性。樣本應有足夠的大小和適當?shù)闹?/p>

復次數(shù)，以估計處理之間、實驗室和實驗室間的變異性。一般可根據(jù)顯著性水準、檢驗把握度、容

許誤差、總體標準差等來估計樣本的大小。

嚴格執(zhí)行毒理學試險設計的上述要求，才可能得到可靠性和重復性良好的結(jié)果，也是進行正確

的統(tǒng)計學評價的基礎。良好的質(zhì)量保證和實驗設計可以監(jiān)控系統(tǒng)誤差，而統(tǒng)計處理則用來確定隨機

誤差。

毒理學試驗的數(shù)據(jù)通常是由劑量水平和相應觀察值組成的二維關系型數(shù)據(jù)。毒理學試驗處理組

與陰性對照組觀察值均數(shù)的比較，如果資料可擬合某種分布，則適用于參數(shù)檢驗，其敏感度和效率

高于非參數(shù)檢驗；如資料不能擬合某些已知的分布，則應進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，以滿足正態(tài)性和方差齊性。

如果任何變換都不能改善數(shù)據(jù)的分布，可能存在個別可疑值，應予以識別和剔除。另一方面，可使

用不依敕總體分布模型的非參數(shù)統(tǒng)計分析。

一種毒理學試驗資料可以有若干種正確的統(tǒng)計學分析方法，但可能不存在唯一正確的方法。其

原因主要是表面上不同的統(tǒng)計學分析方法常以相同的統(tǒng)計學概念和模型為基礎。另一方面，利用不

同的統(tǒng)計學方法來評價毒理學試瞼資料缺乏比較研究。

①.各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個處理組與陰性對照組比較各處理組與陰性對照組兩

兩比較和多個處理組與陰性對照組比較常用的統(tǒng)計學方法見表1-3。

表1-3各處理組與陰性對照組兩兩比較和多個比較的統(tǒng)計學方法

連續(xù)性數(shù)據(jù)，方差正態(tài)分布離散性數(shù)據(jù)

類型泊松分布分布未知

齊方差不齊二項分布

處理組與陰卡方檢驗,FisherU檢驗非參數(shù)法，如

性對照組兩t檢驗t1檢驗確切概率法，U檢WiIcoxon秩和

兩比較驗檢驗

多個處理組平方根反正弦轉(zhuǎn)換，

Dunnctt檢改進的

與陰性對照再用dunnett檢驗，Suissa和

驗DUNnett檢非參數(shù)法，如多

組比較或者Simes法(1986)Salmi法

(1955)驗(1980)(1989)重比較秩和檢驗

(Steel>1959)

②.劑量-效應關系和劑量-反應關系

劑量-效應關系和劑量-反應關系是毒理學研究的重要容。在急性毒性(LDQ研究中，就是典型的

劑量-反應關系研究，Lh是統(tǒng)計學的點值估計和區(qū)間估計。在其他毒理學試驗中的陽性劑量-效應關

系和劑量-反應的確定也應通過統(tǒng)計學處理和判定，盡管，可以用各處理組與陰性對照組兩兩比較和

各處理組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)高劑量組與中、低劑量組及時照組間差別有顯著性，中劑量組與低劑量

組和對照組間差別有顯著性，低劑量組與對照組間差別無顯著性，來證明有劑量-反應關系；但這種

方法的效率較低。劑量-效應關系和劑量-反應的判定可以分為定性和定量統(tǒng)計學兩大類。劑量-效應

關系和劑量-反應關系的統(tǒng)計學定性分析即為趨勢檢驗，而統(tǒng)計學定量分析則為模型擬合。趨勢檢驗

是檢驗對自變量”規(guī)定的水平，反應的觀察值增高或降低的趨勢的顯著性。當自變量s為定量數(shù)據(jù)

時，則可進行模型擬合，即劑量-反應關系的定量研究。

趨勢試驗’(trendtesting)，劑量為Xi；反應為Ui,當有X?！碭|V…VXK,無效假設為

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Ho：u,=u。=…二皿備擇假設為Ha：uWUoW…W小或ui>…2UK單調(diào)上升或單調(diào)下降趨

勢。如反應八為連續(xù)資料服從正態(tài)分布，當x,為定量數(shù)據(jù)，則可選用簡單的線性回歸或加權線性回

歸；如反應口：為離散資料服從二項分布或泊松分布，可選用Cochran-Armitage趨勢檢驗；如果

樣本所屬的總體分布未知，則可利用非參數(shù)法加Jonckheere-Terstra趨勢檢驗（Jonckheere,1954）

0

在毒理學數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學方法中最主要的發(fā)展是劑量-反應關系的統(tǒng)計學方法、超離差

（overdispersion）計數(shù)資料的統(tǒng)計學方法及廣義線性模型（generalized1inearmodeI）。這些

方法，可以利用統(tǒng)計程序包如SAS,Genstat等來實現(xiàn)。

③.對常規(guī)毒理學試驗資料推薦的統(tǒng)計學方法（Cad等，1994）

A體重和器官重量：體重常是毒性效應最敏感的指標之一。如果每組樣品量足夠大（10或10個

以上），可用下述方法：

器官重量計算為體重的百分比。

按體重或體重改變分析。如在試驗開始，動物隨機化分組（各組體重均數(shù)差別無顯著性，各組

所有的動物體重在總平均體重的2個SD之），利用體重改變分析比較好。

對各組資料利用Bartlett方差齊性試驗，檢測方差齊性。根據(jù)方差齊性或不齊，決定進一步的

統(tǒng)計學檢驗。如果樣本量較小，可利用KruskalTalIis非參數(shù)檢測。

B臨床化學：過去一般用t檢驗或AN0VA,但并非是最適當?shù)姆椒?。因為這些生化參數(shù)很少是彼

此獨立的。通常，所研究的并不是單獨某一個參數(shù)，而是與靶器官毒作用有關的一組參數(shù)，如CPK,

HBDH和LDH同時增高強烈指示心肌損害。這時我們并不只是注意其中一個參數(shù)的增高，而是全部3

個參數(shù)。而血清電解質(zhì)（如鈉、鉀、鈣）常相互影響，一種降低常伴另一種增加。而且資料的性質(zhì)，

由于這些參數(shù)的生物學性質(zhì)或測定的方法，常不服從正態(tài)分布（為偏態(tài)分布）或為非連續(xù)的，如肌

甘、鈉、鉀、氯、鈣和血尿素氮。臨床化學資料適用的統(tǒng)計學方法：①ANOVA,Bartlett檢驗和/或

F檢驗，L檢驗，適用于：鈣、葡萄糖、BUN、肌甘、膽堿脂酶、總蛋白、白蛋白、HBDH、ALP、CPK、

LDH、ALT、AST及血紅蛋白。②KruskalTallis非參數(shù)AN0VA適用于：總膽紅素、GGTo

C血液學：不同物種、品系的實驗動物血液學檢查的數(shù)據(jù)，所服從的分布也可能是不同的。這

些參數(shù)的大部分是相互有關的，并依賴于所用的測定方法。RBC數(shù)、血小板數(shù)和MCV可用儀器測定，

數(shù)據(jù)適用于參數(shù)檢驗。紅細胞壓積（HCT）是由RBC和MCV得到的計算值，故依賴于此兩個參數(shù)；但

如直接測定，也可用參數(shù)檢驗。

血紅蛋白是直接測定的并是獨立的連續(xù)數(shù)據(jù)。但如同時存在血紅蛋白的多種形態(tài)（氧血紅蛋白、

脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白等），則可能不是典型的正態(tài)分布，而呈多模型分布。

此時可用wiIcoxon檢驗或多重秩和檢驗。

WBC總數(shù)服從正態(tài)分布，并適用于參數(shù)檢驗。而WBC的分類或報告為百分比或乘以WBC總數(shù)得

“絕對”分類UBC數(shù)。這些資料，特別是嗜酸性粒細胞不符合正態(tài)分布，應該用非參數(shù)統(tǒng)計。

應注意，單個參數(shù)的變化很少有生物學意義，因為這些參數(shù)是相互有關的，應注意發(fā)現(xiàn)并分析

預期的參數(shù)變化譜。

D組織病理學損害發(fā)生率：在亞慢性和慢性毒性試驗，強調(diào)了組織病理學檢查。統(tǒng)計學分析是

評價處理組動物組織病理學損害發(fā)生率是否高于對照組動物。除了癌發(fā)生率外，也應注重發(fā)現(xiàn)其他

病理損害。在處理組和對照組動物病理損害發(fā)生率比較常用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。利用雙側(cè)

檢驗還是單側(cè)檢驗取決于研究者的要求。對于多重比較可用Bonferroni法，而且可利用趨勢檢驗來

評價劑量-反應關系。

E生殖毒性：對生殖毒性的統(tǒng)計學分析，是以窩（或妊娠雌性動物）為實驗單位，而不是幼體。

生殖毒性試驗一般可得4個變量：生有力指數(shù)（FI）、受孕指數(shù)（GI）、存活力指數(shù)（VI）和哺育

指數(shù)（LI）。對這些變量，如樣本數(shù)為10或10以上可利用WiIcoxon-Mann-whitneyU檢驗或

KrusKalTalIis非參數(shù)ANOVAo如樣本數(shù)小于10,則可用WiIcoxon秩和檢驗（用于2組比較）或Aruska

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1-wal1is非參數(shù)ANOVA（用于3組或3組以上的比較）。

F致畸試驗：每組應有20只妊娠動物。并且，實驗單位為窩，而不是胎體。如樣本數(shù)為10或10

以上，可近似為正態(tài)，利用參數(shù)檢驗（如卡方檢驗、t-檢驗或ANOVA）、來評價結(jié)果。當樣本數(shù)小于

10,可用非參數(shù)檢驗（Wi1coxon秩和檢驗或Kruskal-wa11is非參數(shù)ANOVA）□此外,WiIcoxon-

Mann-whitneyU檢驗也廣泛用于致畸試驗。

G飼料和染毒柜中受試物濃度分析：當受試物摻入飼料進行喂飼試驗，或為氣溶膠吸入試瞼，

應定期測定飼料中受試物濃度和染毒柜中受試物氣溶膠的濃度。采樣應隨機并有代表性。一般要求

飼料或空氣中濃度應在預定濃度的±10%之；顯著增高的峰濃度可能超過代或修復系統(tǒng)能力，出現(xiàn)急

性毒作用。如果不了解飼料/空氣中真實的暴露水平，可能錯誤地解釋該受試物的低水平慢性毒性。

氣溶膠顆粒直徑分級采樣可能得到分類資料（如＞100Um,100-25um,25-1051,10~3um等），

這種斐料應該用幾何均數(shù)及其標準差來描述。

II致突變性試驗：絕大多數(shù)遺傳毒理學短期試驗（SH）的觀察值為計數(shù)資料（如突變體數(shù)、畸

變數(shù)、SCE數(shù)）或是相對數(shù)（如存活細胞的突變頻率），因此sn結(jié)果的統(tǒng)計學主要是對離散性資料

的統(tǒng)計學推斷。

最常用的遺傳毒理學試驗的統(tǒng)計學方法：

a）Ames試驗的統(tǒng)計學評價：Ames試驗的結(jié)果每平板回變菌落數(shù)的分布不完全服從泊松分析，

有超離差現(xiàn)象；并且，其劑量反應曲線呈先上升后下降的傘形。Ames等1975年提出2倍判斷標準，

在1983年改進的方法中已不再推薦。2倍判斷標準有較大的缺點，此判斷標準不是統(tǒng)計學判斷，對

自發(fā)回變率較高的菌株偏嚴，而對自發(fā)回變率較低的菌株偏松。已發(fā)展了幾種統(tǒng)計學方法用于Ames

試驗的假設檢驗和劑量反應研究。Kim和Margolin等（1999）利用基于生物學的機制模型，發(fā)展了

SALM程序，用于Ames試瞼結(jié)果的判斷。

b）遺傳毒理學體試驗：（包括微核試驗、染色體畸變試驗和顯性致死試驗）的統(tǒng)計學評價：Adler

等（1998）提出了3步法。①確定實驗結(jié)果是否可接受。如果同時進行的陰性對照的均數(shù)在歷史性

對照的均數(shù)±3SD之，則該實驗結(jié)果可以接受。如果不接受，則應重新進行實驗。②劑量-反應分析。

利用同時進行的陰性對照資料進行劑量-反應趨勢檢驗。有統(tǒng)計學顯著性的陽性趨勢表明受試物處理

的效應。③評價各個處理組反應，然后將各個處理組的均數(shù)分別與歷史性陰性對照比較，如各個處

理組均未顯示差別顯著性，但趨勢檢驗有顯著性意義，此實驗結(jié)果的解釋需要生物學判斷。如果趨

勢無顯著性，但經(jīng)多重比較校正后僅一個處理組與歷史性陰性對照比較差別有顯著性（SimesRJ.

Biometrics1986；73：751-754）,則此試驗結(jié)果的解釋也需要生物學判斷。這時，可認為該實驗

的結(jié)果為可疑。

同時陰性對照與歷史性對照---------------重新試驗

（均數(shù)±3SD）比較在國之外

I在國之

用同時陰性對照進行趨勢檢驗

有顯著性II無顯著性

各處理組與歷史、/各處理組與歷史

性陰性對照比較性陰性對照比較有顯著性I無顯著性I有顯著性I有顯著性

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陽性可疑陰性

圖5-2遺傳毒理學體試驗統(tǒng)計學評價的程序。

I行為毒理學：行為毒理學試驗一般得到4種類型的資料：①觀察的記分值，來自開闊場試臉

等；②反應率，來自舔液，總活動或壓桿；③錯誤率，來自學習-記憶試臉④到達終點的時間。對這

些數(shù)據(jù)常用的和推薦的統(tǒng)計學方法見表1-4。行為發(fā)育毒性和生殖毒性研究的統(tǒng)計學方法也見表-4,

在斷乳前應以窩為實驗單位進行統(tǒng)計。

表1-4行為毒理學的統(tǒng)計學方法(Gad等，1994)

觀察類型常用的方法推薦的方法

觀察記分值t檢驗或單例ANOVAKruskal-Wal1is非參數(shù)ANOYA或WiIcoxon秩和檢

反應率錯t檢驗或單側(cè)ANOVA驗

誤率ANOVA檢驗，再進行Posthoc檢Kruskal—wal115.50丫八或一倒,gO1小

Fisher精確檢驗或RXC卡方，Mann-WhitneyU

到達終點時間t檢驗或一側(cè)ANOVA檢驗

ANOVA檢驗再進行Posthoc檢驗或

行為發(fā)育或生殖試駿ANOVA檢驗，再分別進行檢驗Kruskal-WalIisANOVAA

Fisher精確檢驗或Kruskal-WalIis非參數(shù)ANOVA

2、統(tǒng)計學意義和生物學意義

在評價毒理學試驗結(jié)果時，要綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學意義和生物學意義。

一般來說，具有統(tǒng)計學意義是具有生物學意義的必要條件之一。正確地利用統(tǒng)計學假設檢瞼的

結(jié)果有助于確定實驗結(jié)果的生物學關聯(lián)。在判斷生物學意義(即生物學重要性)時，可考慮以下步.驟。

(1)縱向比較：此參數(shù)的改變有無劑量-反應關系?；瘜W物毒作用的劑量-反應關系是毒理學研究

的基本假設。當某參數(shù)的改變存在陽性劑量-反應關系，就可認為此參數(shù)的改變與受試物染毒有關，

具有生物學意義。

(2)橫向比較:此參數(shù)的改變是否伴有其他相關參數(shù)的改變。例如，生化參數(shù)很少是彼此獨立的，

單個劑量組的一個參數(shù)有統(tǒng)計學顯著性的改變一般不認為有生物學意義，除非此改變?yōu)槠渌麉?shù)改

變所支持。如沒有骨髓或脾組織學改變或沒有高鐵血紅蛋白生成，則單有紅細胞計數(shù)的改變是沒有

生物學意義的。同樣，在免疫毒理學中，單有淋巴細胞計數(shù)的改變不伴有淋巴結(jié)組織學改變也可能

是沒有生物學意義的。

(3)與歷史性對照比較：由于目前尚無公認的實驗動物參考“正常”值，應由本實驗室利用相同

品系的實驗動物和相同的溶劑，進行至少10次獨立實驗的陰性(溶劑)對照的資料構成，以其均值

±1.96X標準誤作為參考值的圍。同時進行的陰性對照應在歷史性對照的均數(shù)±3SD圍之，否則應

重新試驗。另有認為，凡某種觀察值與對照組比較，差別具有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),并符合下列情

況之一者，即可認為已偏離正常參考值圍，屬于有害作用。①其數(shù)值不在正常參考值圍之?②其數(shù)

值在正常參考值圍之，但在停止接觸后，此種差異仍持續(xù)一段時間；③其數(shù)值在正常參考值圍之，

但如機體處于功能或生化應激狀態(tài)下，此種差異更加明顯。應該指出，后兩種情況需要附加的試驗

設計。

另外，還有一些其他的考慮。如處理組同時與對照組兩組均數(shù)之差值應超過檢測誤差的兩倍以

上。某些血液生化指標(如AST、ALT等)的測定值升高才有生物學意義。

當處理組數(shù)據(jù)與陰性對照組比較差別有顯著性，并且經(jīng)分析認為是與處理有關的生物學效應，

應進一步判斷其為有害效應還是非有害效應。決定一種效應是否為有害作用需要專家的判斷。不同

指標或參數(shù)的生物學意義和重要性是不同的。

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在分析和綜合評價實驗結(jié)果的統(tǒng)計學意義和生物學意義時，可能遇到四種情況，見表一5。在

此表中，第I和第N種情況最為常見，第I種情況是無統(tǒng)計學意義也無生物學意義，第N種情況是

有統(tǒng)計學意義也有生物學意義。但是有時在實驗結(jié)果中會出現(xiàn)第II和第HI種情況。

表1-5毒理學試臉結(jié)果的統(tǒng)計學意義和生物學意義

統(tǒng)計學意義

生物學意義

無有

IIIV

第【H種情況是有統(tǒng)計學意義但無生物學意義，例如在某個亞慢性毒性試驗中，中劑量組動物

血液白細胞計數(shù)低于陰性對照組，差別有顯著性(P<0.05),而高劑量組和低劑量組動物血白細胞計數(shù)

與陰性對照組比較差別無顯著性(P>0.05)o由于在此實驗結(jié)果中未出現(xiàn)劑量-反應關系，因此中劑

量組血液白細胞計數(shù)降低可能是由于偶然因素造成的，沒有生物學意義。但是，如果僅在高劑量組

動物血液白細胞計數(shù)降低，與陰性對照組比較差別有顯著性(P<0.05)時，必須仔細地核實高劑量組

的資料。如果資料無任何疑問，可認為此變化可能具有生物學意義。最好是重新進行一個亞慢性毒

性試驗，并加大受試物的劑量，如果能夠觀察到劑量-反應關系，則說明此劑量組血白細胞計數(shù)降低

是有生物學意義的；如果加大受試物劑量沒有觀察到劑量-反應關系，才可以說此劑量組血白細胞計

數(shù)降低沒有生物學意義。因此，在判斷實驗結(jié)果的生物學意義時，有無劑量-反應關系是關鍵。有統(tǒng)

計學意義但無生物學意義的情況，更常見的是因為實驗設計和實施不良所致。

第H種情況是具有生物學意義但無統(tǒng)計學意義，這可能是因為該事件的發(fā)生是極端罕見的，例

如在哺孔動物致癌試驗中，在染毒組中出現(xiàn)對照組中沒有的腫瘤類型，盡管從統(tǒng)計學上此種腫瘤的

發(fā)生率很低，與對照組比較差別無顯著性(P>0.05),但還應該認為是有生物學意義的。

利用一種以上的實驗動物，當某種效應在一個物種出現(xiàn)而在另一物種不出現(xiàn)，或一個物種遠比

另一物種敏感時，則使結(jié)果的解釋復雜化，難以確定以哪個物種的實驗結(jié)果外推到人最為合適。除

非有足夠的資料(通常是比較毒動學或毒效學資料)可以表明最合適的物種，一般是以最敏感的物種

來確定N0AEL和安全限值。

以上我們討論了毒理學動物實驗的基礎,介紹了對外源化學物進行毒性評價的實驗設計、實施、

結(jié)果分析等各個環(huán)節(jié)。實驗的質(zhì)量控制是保證實驗數(shù)據(jù)具有科學性、準確性和公正性的先決條件。

沒有質(zhì)量保證，實驗數(shù)據(jù)的可靠性是無法肯定的。

我們在安全性毒理學試驗設計'實施、總結(jié)報告的各個環(huán)節(jié)上，應該自覺、主動地遵循GLP原

則，逐步從人員的組成和職責、設施、設備、質(zhì)量保證部門(QAU)、標準操作規(guī)程(S0P)、受試品與

對照品、實施方案、實驗記錄和總結(jié)報告等各個方面落實GLP。

實驗二實驗動物的一般操作技術

一、目的和意義

毒理學研究需要用實驗動物來進行各種實驗，通過對動物的實驗觀察和分析來研究毒作用，獲

得毒物的毒性、劑量一反應關系、毒作用機制等方面的資料，因此動物實驗是毒理學研究中重要的

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手段之一。

通過本次實習學習毒理學實驗中有關動物實驗的基本操作技術，掌握實驗動物的選擇、動物抓

取、染毒方法和生物材料的采集等技術。

二、容

（二）健康動物的選擇

無論選擇哪種種屬品系的動物進行實驗，均要求選擇健康的實驗動物。健康動物檢查時要求達

到：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動迅速，反應靈活，食欲及營養(yǎng)狀

況良好。選擇時重點檢查以下項目：

1.眼睛明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無分洪物。

2.耳耳道五分泌物溢出，耳殼無膿瘡。

3.鼻無噴嚏，無漿性粘液分泌物。

4.皮膚無創(chuàng)傷、無膿瘡、疥癬、濕疹。

5.頸部要求頸項端正，如有歪斜提示可能存在耳疾患，不應選作實瞼動物。

6,消化道無嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。

7.神經(jīng)系統(tǒng)無宸顫、麻痹。若動物（大鼠、小鼠）出現(xiàn)圓圈動作或提尾倒置呈圓圈擺動，應放

棄該動物。

8.四肢及尾四肢、趾及尾無紅腫及潰瘍。

（二）實驗動物的性別鑒定

動物性別不同對毒物的敏感性也不同，這可能與性激素、肝微粒體羥基化反應有關，也隨受試

物而異。因此，要根據(jù)實驗要求選擇性別，一般實驗如對性別無特殊要求者，宜選用雌雄動物各半。

1.大鼠、小鼠主要依肛門與生殖器孔間的距離加以區(qū)分。間距大者為雄性，小者為雌性。雌

性生殖器與肛門之間有一無毛小溝，距離較近。雄性可見明顯的陰囊，生殖器突起較雄鼠大，肛門和

生殖器之間長毛。另外成年雄性臥位可見到睪丸，雌性在腹部可見乳頭。

圖2T雌雄動物肛門與外生殖器間距離

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2.豚鼠用一只手抓住豚鼠頸部，另一只手扒開靠生殖器孔的皮膚，雄性動物在圓孔中露出性

器官的突起，雌性動物則顯出三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個乳頭。

3.家兔將家兔頭輕輕夾在實驗者左腋窩下，左手按住腰背部，右手拉開尾巴并將尾巴夾在中

指和無名指中間，然后用拇指和食指稍稍把生殖器附近的皮膚扒開。雄兔即可見到一圓孔中露出圓

錐形稍向下彎曲的陰莖（但幼年雄兔看不到明顯的陰莖，只能看到圓孔中有凸起物，即是陰莖）。

雌兔此處則為一條朝向尾巴的長縫，呈橢圓形的間隙，間隙越向下越窄，此即為陰道開口處。

?性

圖2-2兔雌雄生殖器外型特征與差異

（三）實驗動物的抓取方法

正確地抓取固定動物，是為了在不損害動物健康、不影響觀察指標、并防止被動物咬傷的前提下，

確保實驗順利進行。

1.小鼠的抓取方法首先用右手從籠盒抓取鼠尾提起，注意不可抓尾尖（見圖A）,放在鼠籠蓋或

實驗臺上向后拉（見圖B）,在其向前爬行時，迅速用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚（見

圖C），將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無名指按住鼠尾，小指按住后腿即可（見圖D）。

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D

圖2-3小鼠的抓取

2.大鼠的抓取方法大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。

為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背

皮膚，置于左掌心中，這樣右手可進行各種實驗操作。

AB

圖2-4大鼠的抓取

3.豚鼠的抓取方法豚鼠膽小易驚，在抓取時要穩(wěn)、準、迅速。用手掌迅速扣住鼠背,

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抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部（見圖A），另一只手托住臀部即可（見圖B）。

B

豚鼠的抓取

4.兔的抓取方法用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部

分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。

圖2-6兔的抓取

（四）實驗動物稱重、編號、標記方法

1.稱重大、小鼠秤的感應量需在0.1g以下。根據(jù)實驗的不同要求，選擇一定數(shù)量的大、小鼠，

體重要求在同一組、同性別動物體重差異應小于平均體重的10%,不同組間同性別動物體重均值差異應

小于5%0

2.編號動物編號方法有多種。大、小鼠常用方法如下：

（1）染色法：染色法是用化學劑在動物身體明顯部位如皮毛、四肢等處進行涂染，或用不同顏色

等來區(qū)別各組動物，是實瞼室最常用、最容易掌握的方法。

常用的標記液有苦味酸酒精飽和溶液（黃色）。標記時，用標記筆取上述溶液，在動物體表不同部位

涂上斑點，以示不同。一般把涂在右前肢上的記為1號，按順時針方向，依次右后肢為2號，左后肢

為3號，左前肢為4號，頭部為5號（見圖2-7A）,670則由以上5個基本數(shù)復合而成，比如6號則

是在頭部和右前肢標記各一（見圖2-7B）,7號為在頭部和右后肢體標記一，以此類推。在動物的背

部劃一長條為10號。10號以上均由上述復合方法進行編號。例如：16號是在頭部、右前肢、背部均

有標記（見圖2-7C）。

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(2)剪耳法：在耳朵不同部位剪一小孔代表某個。常以右耳代表個位，左耳代表十位?；蚺c染色法

配合使用，右耳剪孔代表十位。

圖2-8小動物剪耳法標記

(3)烙印法：是用刺數(shù)鉗在動物耳上刺上，然后用棉簽蘸著溶在酒精中的黑墨在刺號上加以涂抹，

烙印前最好對烙印部位預先用酒精消毒。

(4)號牌法：用金屬的牌號固定于實驗動物的耳上，大動物可系于頸上。

(五)實驗動物的分組方法

為了得到客觀的劑量一反應關系，應將一群動物按統(tǒng)計學原則隨機分配到各個實驗組中?？砂措S

數(shù)字表方法進行隨機分組(見隨機數(shù)字表方法分組說明)。但小動物的年齡和體重呈正相關，而年齡又

與毒物代動力學密切相關。為了減少實驗各組動物間的體重差異，在實際工作中常采用體重均衡法(簡

化分層隨機法)進行分組，即將同一性別的動物按體重大小順序排列，