骨髓檢查及細(xì)胞化學(xué)染色檢驗

骨髓檢查及細(xì)胞化學(xué)染色檢驗骨髓檢查及細(xì)胞化學(xué)染色檢驗熟悉：正常血細(xì)胞對化學(xué)染色的反應(yīng)。第2頁,共66頁，2024年2月25日，星期天骨髓檢查及細(xì)胞化學(xué)染色檢驗了解：流式細(xì)胞儀的構(gòu)造、原理、主要技術(shù)指標(biāo)和臨床應(yīng)用。

染色體分析在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用。分子生物學(xué)檢查在血液學(xué)中的應(yīng)用。常用FISH技術(shù)的種類、原理、方法和臨床應(yīng)用。常用造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)的種類、原理和臨床應(yīng)用。非顯帶染色體和顯帶染色體相關(guān)概念和技術(shù)。常見染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的有關(guān)概念和表示方法。核酸分子雜交技術(shù)原理和方法。聚合酶鏈反應(yīng)原理和常用PCR產(chǎn)物檢查方法。以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)。細(xì)胞凋亡概念，細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的基本變化及主要生物化學(xué)特征。細(xì)胞凋亡的機制。第3頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞化學(xué)染色檢驗細(xì)胞化學(xué)染色，是一種以細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合運用化學(xué)反應(yīng)的原理對血細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)物質(zhì)作定位、定性及半定量分析的方法。第4頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞化學(xué)染色檢驗血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。第5頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞化學(xué)染色檢驗基本步驟固定：蒸汽、液體固定有色沉淀反應(yīng)：偶氮偶聯(lián)法、普魯士藍(lán)反應(yīng)、雪夫反應(yīng)、聯(lián)苯胺法復(fù)染第6頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞化學(xué)染色檢驗臨床意義輔助判斷急性白血病的細(xì)胞類型輔助血液系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷觀察疾病療效和判斷預(yù)后

探討某些疾病的發(fā)病機制

第7頁,共66頁，2024年2月25日，星期天一、過氧化物酶染色（POX）原理：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿中含有的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）能將底物過氧化氫分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧，它將四甲基聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)自我脫氫氧化，顯棕色四甲基苯醌二胺，再加入亞硝基鐵氰化鈉與聯(lián)苯胺藍(lán)結(jié)合，可形成穩(wěn)定的藍(lán)色顆粒，定位于細(xì)胞漿內(nèi)酶所在的部位。第8頁,共66頁，2024年2月25日，星期天POX結(jié)果判斷細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)黑色顆粒者為陽性。（－）無顆粒沉著；（a）（±）顆粒細(xì)小，分布稀疏；（b）（+）顆粒較粗，局灶分布；（c）

（++）顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì)1/2~2/3；（d）（+++）顆粒粗大，呈團塊分布；（e）（++++）全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核（f）。第9頁,共66頁，2024年2月25日，星期天各種細(xì)胞過氧化物酶染色

嗜堿粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞原幼粒細(xì)胞第10頁,共66頁，2024年2月25日，星期天骨髓片POX染色第11頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共66頁，2024年2月25日，星期天臨

床

意

義

POX染色是輔助診斷急性白血病細(xì)胞類型的首選、最重要的細(xì)胞化學(xué)染色。（1）粒系：POX主要分布在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，隨著粒細(xì)胞成熟的程度而逐漸增強，中性分葉核粒細(xì)胞為強陽性。

嗜酸性粒細(xì)胞陽性程度最強，其陽性顆粒比中性粒細(xì)胞粗大，有折光。

嗜堿性粒細(xì)胞為陰性。第14頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）單核細(xì)胞：

原始單核細(xì)胞為陰性反應(yīng)，幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)小，彌散分布。臨

床

意

義第15頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（3）其他細(xì)胞淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、組織細(xì)胞、巨核細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。（4）血小板過氧化物酶主要定位于幼稚型巨核細(xì)胞的核膜上，可作為原巨核細(xì)胞的一種標(biāo)志物，有助于FABM7的識別。臨

床

意

義第16頁,共66頁，2024年2月25日，星期天骨髓片POX染色APL：呈強陽性反應(yīng)AML-M4：部分呈陽性反應(yīng)，部分成弱陽性反應(yīng)AML-M5：呈弱陽性ALL：呈陰性，<3%第17頁,共66頁，2024年2月25日，星期天臨床意義（5）過氧化物酶染色主要用于鑒別急性白血病類型，急性髓細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強，M1和M5型反應(yīng)較弱，故有助于區(qū)別M3和M5型。急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。第18頁,共66頁，2024年2月25日，星期天二、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色（NAP）原理：（偶氮藕聯(lián)法，Kaplow）

中性粒細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶（neutrophilicalkalinephosphatase,NAP）在pH9.2~9.8時，能水解磷酸萘酚鈉，釋放出磷酸與萘酚，再以重氮鹽與萘酚偶聯(lián)成不溶性有色沉淀于胞質(zhì)內(nèi)酶所存在的部位。第19頁,共66頁，2024年2月25日，星期天NAP結(jié)果判斷陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)灰褐色至深黑色顆粒狀或片狀沉淀①（－）胞漿呈淡紅色，為0分。②（＋）胞質(zhì)出現(xiàn)灰褐色沉淀，為1分。③（＋＋）胞質(zhì)深褐色沉淀，為2分。④（＋＋＋）胞質(zhì)中已基本充滿棕黑色顆粒狀沉淀，但密度較低，為3分。⑤（＋＋＋＋）胞質(zhì)全被深黑色團塊沉淀所充滿，密度高，甚至遮蓋胞核，為4分。

第20頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

NAP積分法

計數(shù)100個成熟中性粒細(xì)胞，按其反應(yīng)強度分級，各級百分率與其級數(shù)乘積的總和，即為積分。例如：NAP反應(yīng)結(jié)果（%）（-）（+）（++）（+++）（++++）

204020155

積分=（0×20）+（1×40）+（2×20）+（3×15）+（4×5）=145

參考值：正常人血細(xì)胞堿性磷酸酶除成熟中性粒細(xì)胞（桿狀核及分葉核）可見陽性外，其他血細(xì)胞均為陰性。中性粒細(xì)胞NAP活性積分值一般為10～50分，但有時可高達(dá)162分。

第22頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

臨床意義（1）生理變化：新生兒NAP增高，成人較兒童減低，老人更低；激烈運動增高；

月經(jīng)期經(jīng)前增高，行經(jīng)后降低，經(jīng)后期恢復(fù)正常；

妊娠期2-3月輕度增高，以后逐漸增高，分娩時達(dá)到高峰，產(chǎn)后恢復(fù)正常。第23頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（2）、病理變化

增高：嚴(yán)重化膿性感染、類白血病反應(yīng)、AA、CML加速期、ALL、CLL、惡性淋巴瘤、癌轉(zhuǎn)移、MM、真紅、骨髓纖維化等。

減低：PNH、CML、惡性組織細(xì)胞病、MDS。第24頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共66頁，2024年2月25日，星期天三、蘇丹黑染色（SBB）原理：蘇丹黑B（sudanblackB,SB）是一種能溶解于脂肪中的色素染料，可使細(xì)胞內(nèi)的中性脂肪、磷脂和類固醇著色，即使胞內(nèi)微細(xì)結(jié)構(gòu)的脂類物質(zhì)也能顯示出來。結(jié)果

：脂類呈黑色或棕黑色顆粒，定位于細(xì)胞漿中（+）顆粒很小，細(xì)小、稀疏，或胞質(zhì)局部面積的1/4有致密的顆粒。（++）顆粒較少，或胞質(zhì)面積的1/2出現(xiàn)黑色顆粒。（+++）顆粒較密，或胞質(zhì)面積的3/4出現(xiàn)黑色顆粒。（++++）顆粒極密，顆粒間無間隙。第27頁,共66頁，2024年2月25日，星期天各種細(xì)胞蘇丹黑B染色第28頁,共66頁，2024年2月25日，星期天臨床意義蘇丹黑B和過氧化物酶染色臨床意義相似主要用于急性白血病類型的鑒別。蘇丹黑B染色較過氧化物酶染色更敏感，但特異性不如過氧化物酶染色（極少數(shù)急性淋巴細(xì)胞白血病可為陽性）。第29頁,共66頁，2024年2月25日，星期天M1-SBB(+)第30頁,共66頁，2024年2月25日，星期天M2-SBB(+)第31頁,共66頁，2024年2月25日，星期天四、鐵染色原理：骨髓中的含鐵血黃素（細(xì)胞外鐵）和中、晚幼紅細(xì)胞胞漿中的鐵蛋白聚合物（細(xì)胞內(nèi)鐵）經(jīng)普魯士藍(lán)反應(yīng)形成藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于細(xì)胞內(nèi)外鐵存在的部位。正常人骨髓細(xì)胞外鐵為+~++。鐵粒幼細(xì)胞陽性率為12%~44%。鐵染色（ironstain；IS）中的細(xì)胞外鐵反映骨髓中鐵的儲存量，細(xì)胞內(nèi)鐵反映骨髓中可利用鐵的量。第32頁,共66頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷（1）細(xì)胞外鐵的觀察：

細(xì)胞外鐵呈藍(lán)色的顆粒狀、小株狀或團塊狀。以油鏡觀察定級標(biāo)準(zhǔn)（-）無鐵?？梢姟＃?）少數(shù)鐵?；蜩F小珠。（++）較多鐵粒和鐵小珠。（+++）很多鐵粒、鐵小珠和少數(shù)小塊。（++++）極多鐵粒、鐵小珠并有很多小塊，密集成堆。正常范圍：+～++，“+”占2/3，“++”占1/3第33頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞外鐵觀察陽性為藍(lán)綠色沉淀++++血色病+++AA、鐵粒幼貧血++感染+++AA、鐵粒幼貧血+NBM—IDA第34頁,共66頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷（2）細(xì)胞內(nèi)鐵觀察：

細(xì)胞內(nèi)鐵指有核紅細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色顆粒，以油鏡計100個中、晚幼紅細(xì)胞，記錄胞質(zhì)中含有藍(lán)色小顆粒（即鐵粒紅細(xì)胞）的比值。并根據(jù)細(xì)胞鐵顆粒的數(shù)目、大小、染色深淺和顆粒分布情況，將鐵粒幼紅細(xì)胞分為如下四型：Ⅰ型：僅含1-2個鐵顆粒。

Ⅱ型：含3-5個鐵顆粒。

Ⅲ型：含6-10個以上鐵顆粒。

Ⅳ型：>10個鐵顆粒。正常范圍：12%~44%，平均21.4%，多見Ⅰ型，少見Ⅱ型，無Ⅲ、Ⅳ型。第35頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞內(nèi)鐵第36頁,共66頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷（3）環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞：指含鐵顆粒>6個，其中1/2以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。正?；蚍氰F粒幼細(xì)貧血無環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，鐵粒幼細(xì)貧血中環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞>6%第37頁,共66頁，2024年2月25日，星期天環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞第38頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

臨床意義1．缺鐵性貧血時，骨髓細(xì)胞外鐵明顯減少，為“一”~“士”，細(xì)胞內(nèi)鐵平均5.9%，僅為I型。經(jīng)有效鐵劑治療后，外鐵增多。因此骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的重要方法。2．鐵粒幼細(xì)胞性貧血時，外鐵“2＋”一“3＋”，內(nèi)鐵平均70%，其鐵粒粗大，以Ⅱ～Ⅳ型為主，出現(xiàn)較多環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞。因此，本實驗是診斷鐵粒幼細(xì)胞貧血的有效方法。MDS也可出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞。

3.非缺鐵性貧血如巨幼細(xì)胞貧血、溶血性貧血、再生障礙性貧血等骨髓鐵正?；虿煌潭鹊脑黾印５偕系K性貧血不會出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，可作為與MDS鑒別的參考。

4.繼發(fā)性貧血的部分患者細(xì)胞內(nèi)鐵可減少，但細(xì)胞外鐵不減少。

第39頁,共66頁，2024年2月25日，星期天五、過碘酸-雪夫染色（PAS）原理：過碘酸-雪夫（Periodicacid-schiff，PAS）染色又稱糖原染色。胞漿內(nèi)存在的糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（Periodicacid）氧化，轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO），與雪夫（Schiff）試劑中的無色品紅結(jié)合，形成紫紅色化合物而沉積于胞漿中糖原類物質(zhì)所存在的部位。該反應(yīng)稱為過碘酸-雪夫（PAS）陽性反應(yīng)。

第40頁,共66頁，2024年2月25日，星期天PAS結(jié)果判斷細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有出現(xiàn)紅色顆粒、塊狀或呈彌漫狀紅色者為陽性。①（－）胞質(zhì)無色，無顆粒。②（+）胞質(zhì)淡紅色或有少量紅色顆粒，通常＜10個顆粒。③（++）胞質(zhì)紅色或有10個以上紅色顆粒。④（+++）胞質(zhì)呈暗紅色或有粗大紅色顆粒，可出現(xiàn)紅色塊狀。⑤（++++）胞質(zhì)呈紫紅色或有粗大紅色塊狀。

第41頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

臨床意義（1）M6與巨幼貧的鑒別

M6的幼紅細(xì)胞PAS可呈強陽性，積分明顯增高，巨貧、再障、溶貧時PAS反應(yīng)為陰性。（2）急性白血病的類型鑒別

ALL，PAS呈大塊狀陽性，也可是陰性，AML為陰性，急性單核細(xì)胞白血病時原單核細(xì)胞及幼單核細(xì)胞PAS陽性，積分增高，陽性顆粒小而多，呈彌散分布。第42頁,共66頁，2024年2月25日，星期天PAS染色AML-M6幼紅細(xì)胞呈陽性反應(yīng)MA幼紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)第43頁,共66頁，2024年2月25日，星期天ALL-L1第44頁,共66頁，2024年2月25日，星期天L1PAS(+)第45頁,共66頁，2024年2月25日，星期天AML-M5第46頁,共66頁，2024年2月25日，星期天M5PAS(+)第47頁,共66頁，2024年2月25日，星期天AML-M6第48頁,共66頁，2024年2月25日，星期天AML-M6PAS(+)第49頁,共66頁，2024年2月25日，星期天AML-M7第50頁,共66頁，2024年2月25日，星期天M7PAS(+)第51頁,共66頁，2024年2月25日，星期天（3）巨核細(xì)胞和Sternberg細(xì)胞鑒別

巨核細(xì)胞PAS強陽性，Sternberg細(xì)胞為陰性或弱陽性。（4）戈謝氏細(xì)胞強陽性，尼曼-皮克細(xì)胞陰性或弱陽性。（5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴細(xì)胞的糖原積分增高；一般的病毒感染，糖原積分在正常范圍內(nèi)。第52頁,共66頁，2024年2月25日，星期天六、氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（NAS-DCE）原理：細(xì)胞內(nèi)的氯乙酸AS－D萘酚酯酶（naphytholAS-Dchloroacetateesterase,NAS-DCE）水解基質(zhì)液中的氯乙酸AS－D萘酚，產(chǎn)生AS－D萘酚，進(jìn)而與基質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所存在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢紫醬GBC，形成的有色沉淀為紅色。NAS－DCE幾乎僅出現(xiàn)在粒細(xì)胞，其特異性高，因此又稱為“粒細(xì)胞酯酶”、“特異性酯酶”。第53頁,共66頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)紅色沉淀①（－）胞質(zhì)無色。②（＋）胞質(zhì)呈淡紅色。③（＋＋）鮮紅色沉淀布滿胞質(zhì)。④（＋＋＋）深紅色沉淀充滿胞質(zhì)。第54頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

臨床意義1．急性粒細(xì)胞白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病原粒細(xì)胞NAS－DCE染色多呈（＋）~（＋＋）。白血病性早幼粒細(xì)胞呈（＋＋）~（＋＋＋）。2．急性單核細(xì)胞白血病原、幼單核細(xì)胞多呈陰性反應(yīng)。3．急性淋巴細(xì)胞白血病原、幼淋巴細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。。第55頁,共66頁，2024年2月25日，星期天七、中性非特異性酯酶染色

原理：中性非特異性酯酶包括醋酸AS-D萘酚酯酶(naphytholAS-Dacetateesterase,NAS-DAE)染色和α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）染色。細(xì)胞內(nèi)的α-醋酸萘酚酯酶（α—naphythyolacetateesterase,α-NAE）在pH中性的條件下水解基質(zhì)液中的α-醋酸萘酚，釋放出α-萘酚，進(jìn)而與基質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。本試驗常用的重氮鹽為堅牢藍(lán)B，形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色，α-NAE存在于單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，故它是一種中性非特異性酯酶。第56頁,共66頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果判斷陽性結(jié)果為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)藍(lán)色或棕黑色顆粒沉淀

①（－）無顆粒沉淀，為0分。②（±）顆粒少量、稀疏，為0.5分。③（＋）胞質(zhì)內(nèi)1/2區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為1分。④（＋＋）胞質(zhì)內(nèi)3/4區(qū)域出現(xiàn)顆粒沉淀，為2分。⑤（＋＋＋）胞質(zhì)內(nèi)布滿顆粒沉淀，為3分。⑥（＋＋＋＋）胞質(zhì)內(nèi)充滿濃密的顆粒沉淀，為4分。第57頁,共66頁，2024年2月25日，星期天

臨床意義NAS－DAE染色屬于中性非特異性酯酶染色，在鑒別白血病類型時需同時做NaF抑制試驗。

1．急性粒細(xì)胞白血病原粒細(xì)胞NAS－DAE染色可呈陽性反應(yīng)，且不被氟化鈉抑制。2．急性早幼粒細(xì)胞白血病白血病性早幼粒細(xì)胞NAS－DAE染色為陽性或強陽性反應(yīng)，亦不被氟化鈉所抑制。3．急性單核細(xì)胞白血病原、幼單核細(xì)胞NAS－DAE染色多呈陽性或強陽性反應(yīng)，但能被氟化鈉抑制

第58頁,共66頁，2024年2月25日，星期天骨髓NAS-DAE染色及氟化鈉抑制反應(yīng)

第59頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共66頁，2024年2月25日，星期天第61頁,共66頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞化學(xué)染色檢驗小結(jié)第62頁,共66頁，2024年2月25日，星期天幾種常見急性白血病的細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果急淋急粒急單紅白血病POX藍(lán)黑色－+~+++－~+視合并的白細(xì)胞類型而定SB黑棕黑色－++~+++－~+同上AS-DNCE紅－－~+++－~+同上α-NAE棕黑－~++－~+++同上α-NAE-NaF不被NaF抑制被NaF抑制同上NAP褐-深黑增加減少正常或增加同上PAS紅+，粗顆粒狀或塊狀－或+，彌漫性淡紅色－或+，彌漫性淡紅色+++第63頁,共66頁，2024年2月25日，星期天各型急性白血病細(xì)胞的化學(xué)染色特征

POXPASNAS－DCENAS－DAE（＋NaF） NAP

急淋（L1-L3

）

(-)