微生物與基因工程

微生物與基因工程5/8/20241微生物與基因工程RecombinantDNAtechnologyhasbeenusedtocreategeneticallymodifiedcrops.Geneticallyengineeredcorn,whichproducesatoxinthatkillsinsectpests,nowcomprisesover30%ofallcorngrownintheUnitedStates..)5/8/20242微生物與基因工程RestrictionenzymeMocularcloningDNAsequencingGeneticsengineering5/8/20243微生物與基因工程基本過程●分離或者合成基因●體外重組●導(dǎo)入細胞●擴增●篩選●鑒定或測序●控制外源基因表達●得到基因產(chǎn)物5/8/20244微生物與基因工程基因工程的基本步驟基因分離酶切載體酶切連接轉(zhuǎn)化篩選表達5/8/20245微生物與基因工程基因工程的基本步驟(示意圖)5/8/20246微生物與基因工程微生物學(xué)與基因工程●載體●工具酶●宿主●基因來源●理論5/8/20247微生物與基因工程基因工程中常用的工具酶工具酶的種類●核酸降解酶類(核酸內(nèi)切酶,核酸外切酶)●核酸合成酶類(聚合酶,連接酶)●核酸修飾酶類(甲基化酶,基因轉(zhuǎn)移酶,激酶等)5/8/20248微生物與基因工程限制性內(nèi)切酶的命名EcoRI

EscherichiacoliRy13屬名種名株系編號HindIIIHaemophilusinfluenzaedstrain?5/8/20249微生物與基因工程限制性內(nèi)切酶的分類類型IIIIII識別與切割部位分別,隨意切割,相距遠,單鏈切割相同相距5-10bp對基因工程的意思不大大不大5/8/202410微生物與基因工程II類限制性內(nèi)切酶的不同切割方式A.平末端切割5’……CCCGGG……3’3’……GGGCCC……5’5’……CCCGGG……3’3’……GGGCCC……5’SmaIB.粘性末端切割—5’凸出5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’5’……GAATTC……3’3’……CTTAAG……5’EcoRIC.粘性末端切割—3’凸出5’……CTGCAG……3’3’……GACGTC……5’5’……CTACAG……3’3’……GATGTC……5’PstI5/8/202411微生物與基因工程限制性內(nèi)切酶的活性單位指在50μl體系中,于最適宜的條件下(溫度,離子濃度等),一小時內(nèi)完全酶解1μg特定底物DNA所需要的酶蛋白量5/8/202412微生物與基因工程限制性內(nèi)切酶在基因工程中的應(yīng)用產(chǎn)生特異切割5/8/202413微生物與基因工程DNA聚合酶（DNApolymerase）指在DNA或者RNA模板指導(dǎo)下，以4種dNTP為底物，在引物3’—OH末端聚合DNA鏈的一類酶。特點：需要模板，引物，5’3’，具有3‘5’和5‘3’外切作用5/8/202414微生物與基因工程DNA聚合酶I（E.coli）Klenow片段（E.coli）T4DNA聚合酶（T4感染的E.coli）T7DNA聚合酶（T7感染的E.coli）修飾的T7DNA聚合酶（測序）TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶5/8/202415微生物與基因工程載體（vector）克隆載體（cloningvector）表達載體（expressionvector）5/8/202416微生物與基因工程克隆載體以擴增外源DNA為目的的載體。要求？5/8/202417微生物與基因工程5/8/202418微生物與基因工程能夠獨立自主的復(fù)制具有若干個限制酶單一的切割位點具有篩選標(biāo)記克隆載體的要求5/8/202419微生物與基因工程表達載體具有宿主細胞基因表達所需要的調(diào)控序列，能使克隆的基因在宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。5/8/202420微生物與基因工程5/8/202421微生物與基因工程克隆載體－質(zhì)?！窬哂歇毩?fù)制起點●較小的分子質(zhì)量●具有較高的拷貝數(shù)●具有篩選標(biāo)記●容易導(dǎo)入細胞●安全●插入片段（<15kb)5/8/202422微生物與基因工程pBR322插入失活insertionalinactivation5/8/202423微生物與基因工程5/8/202424微生物與基因工程克隆載體宿主基本要求●高效吸收外源DNA●高效復(fù)制外源DNA的酶系統(tǒng)●不具有限制-修飾系統(tǒng)●重組缺陷型菌株●便于基因操作和篩選●具有安全性5/8/202425微生物與基因工程原核生物宿主E.coliB.subtilis真核生物宿主S.cereviaiae哺乳動物細胞昆蟲細胞系5/8/202426微生物與基因工程基因文庫基因組文庫（genomiclibrarycDNA文庫（cDNAlibrary）genomiclibraryAlibraryencompassinganentiregenomecDNAlibraryAlibrarycomposedofcDNAs,notnecessarilyrepresentingallmRNAs.5/8/202427微生物與基因工程ThedifferencesbetweencDNAclonesandgenomicDNAclones

5/8/202428微生物與基因工程基因組文庫的構(gòu)建一般步驟●基因組DNA的分離●部分酶解●分離特定大小的片段●切割載體●連接●轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染●鑒定容量5/8/202429微生物與基因工程cDNA文庫的構(gòu)建一般步驟●mRNA提取●反轉(zhuǎn)錄（oligodT）●cDNA一鏈●RNAaseH●DNAaseI●cDNA二鏈●載體連接●轉(zhuǎn)化5/8/202430微生物與基因工程PreparationofabacteriophagelcDNAlibrary5/8/202431微生物與基因工程基因工程步驟★目的基因的獲得★特異切割（基因，載體）★連接★外源基因?qū)胨拗骷毎镏亟M體篩選5/8/202432微生物與基因工程目的基因的獲得A.正向遺傳學(xué)（forwardgenetics）策略表型改變突變體分離相關(guān)基因野生型突變體突變位點鑒定突變位點序列篩選文庫克隆，亞克隆全序列基因功能確定5/8/202433微生物與基因工程B.反向遺傳學(xué)（reversegenetics）策略基因序列確定功能●基于同源性的反向遺傳學(xué)異源探針保守序列5/8/202434微生物與基因工程●基于蛋白質(zhì)的反向遺傳學(xué)蛋白質(zhì)部分測序推測DNA序列合成DNA篩選文庫克隆，亞克隆蛋白質(zhì)制備抗體原位雜交克隆，亞克隆5/8/202435微生物與基因工程AnefficienttechniquecommonlyusedtodetectabacterialcolonycarryingaparticularDNAclone

5/8/202436微生物與基因工程TheuseofoverlappingDNAclonestofindanewgeneby"chromosomewalking

5/8/202437微生物與基因工程特異切割（基因，載體）連接（基因與載體）5/8/202438微生物與基因工程外源基因?qū)胨拗骷毎怂拗鬓D(zhuǎn)化（質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染（噬菌體，cos質(zhì)粒）真核宿主轉(zhuǎn)化（PEG，CaCl2）fungi微量注射，電穿孔：animalcellTi質(zhì)粒介導(dǎo)plant5/8/202439微生物與基因工程重組體篩選●表型特征鑒定抗生素篩選插入失活插入表達β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)●重組DNA分子結(jié)構(gòu)特征的鑒定菌落原位雜交酶切鑒定PCR序列測定5/8/202440微生物與基因工程●外源基因表達產(chǎn)物的鑒定免疫活性（抗原-抗體反應(yīng)）活性檢查（酶活測定）氨基酸序列平板濾膜裂解固定（蛋白質(zhì)）標(biāo)記抗體檢測5/8/202441微生物與基因工程表達載體構(gòu)建表達載體：具有宿主細胞基因表達所需要的調(diào)節(jié)控制序列，能使克隆的基因在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。5/8/202442微生物與基因工程表達系統(tǒng)的要求與主要調(diào)控元件真核細胞基因在原核細胞中表達時的困難：●真核生物啟動子不能被原核生物細胞RNA聚合酶識別●真核mRNA沒有SD序列，不能結(jié)合原核核糖體●原核細胞缺乏將其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行加工的酶●真核生物基因表達產(chǎn)物容易被原核細胞蛋白酶降解5/8/202443微生物與基因工程●用cDNA●原核啟動子，終止子，SD序列●產(chǎn)生mRNA必須穩(wěn)定●防止外源蛋白降解真核基因的原核表達策略5/8/202444微生物與基因工程表達載體的構(gòu)建啟動子

lacpromoter，trppromoter，tacpromoterPL、Rpromoter，T7promoter核糖體結(jié)合位點（ribosome-bindingsite，RBS）Shine——Dalgarnosequence，SD終止子偏愛密碼子5/8/202445微生物與基因工程非融合蛋白的表達表達載體PSDCodingregionT表達載體5/8/202446微生物與基因工程防止非融合蛋白降解的措施●采用細胞內(nèi)蛋白酶含量低的突變株作為宿主菌●利用蛋白酶抑制劑●分泌蛋白●包涵體5/8/202447微生物與基因工程外源蛋白的分泌表達signal5/8/202448微生物與基因工程融合蛋白的表達表達載體PSDNTCT裂解5/8/202449微生物與基因工程融合蛋白的表達表達高效

穩(wěn)定

直接利用特點分離：酶法，化學(xué)法5/8/202450微生物與基因工程5/8/202451微生物與基因工程基因工程的應(yīng)用及展望5/8/202452微生物與基因工程基因工程在商業(yè)上的主要應(yīng)用領(lǐng)域●微生物發(fā)酵●病毒疫苗●哺乳動物蛋白●轉(zhuǎn)基因動植物●環(huán)境生物技術(shù)●基因調(diào)控和基因治療5/8/202453微生物與基因工程基因工程藥物生物體內(nèi)含量少，作用大的蛋白質(zhì)自然界中不存在的蛋白質(zhì)5/8/202454微生物與基因工程重組胰島素胰島素的生產(chǎn)是基因工程最早也是最大的商業(yè)成功之一用于糖尿病的治療初期胰島素的生產(chǎn)：從牛或豬胰臟中分離（高成本，高價格，低活性）人類胰島素基因的分離成功后，開始應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)胰島素重組胰島素1982年進入市場5/8/202455微生物與基因工程ssssAB生產(chǎn)方法生產(chǎn)胰島素原，化學(xué)切割分別用兩株克隆菌生產(chǎn)A鏈和B鏈，用化學(xué)方法連接5/8/202456微生物與基因工程重組疫苗疫苗：由滅活或經(jīng)過加工的致病微生物或者從微生物上分離的某些成分制成的懸浮液，其注射倒動物體類，會引起動物對相應(yīng)疫病產(chǎn)生免疫力。通常起作用的成分為表面蛋白。5/8/202457微生物與基因工程●第一個用于人體的重組亞單位疫苗是由酵母菌生產(chǎn)的（乙肝表面抗原疫苗，HBsAg）●1986年，F(xiàn)DA正式批準(zhǔn)基因工程疫苗進入市場●美國科學(xué)家在體外將20多種病毒，細菌和寄生蟲的基因重組后插入到卡介苗中，形成多效卡介苗，多多種疾病有作用●DNA疫苗的設(shè)想5/8/2024