HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件

HPV基因分型檢測項目

臨床試驗實際問題5/9/20241HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件目錄試驗開展實驗室要求HPV臨床樣本的采集方法及注意事項臨床試驗操作注意事項臨床試驗結(jié)果分析及常見問題5/9/20242HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件HPV基因分型檢測試驗項目

——試驗開展實驗室要求5/9/20243HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床基因擴增實驗室設置的一般原則各區(qū)獨立注意風向因地制宜方便工作“十六字方針”5/9/20244HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件基因擴增檢驗實驗室工作流程進入各個工作區(qū)必須遵循嚴格的單一方向順序!5/9/20245HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件最佳的HPV基因分型實驗室布局

出口

入口工作流向臨床樣本收集與儲存PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域5/9/20246HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件最佳的HPV基因分型實驗室布局每間房間必須有其專用的工作服及一次性手套；每個工作區(qū)都應有獨立的一套儀器設備及耗材；不同區(qū)域的儀器設備及耗材不能混用;臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)試劑準備區(qū)超凈工作臺DNA提取PCR擴增區(qū)導流雜交區(qū)結(jié)果通知患者5/9/20247HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件基礎HPV基因分型實驗室布局（1）

臨床樣本(原始容器中)樣本制備區(qū)超凈工作臺DNA提取導流雜交區(qū)結(jié)果通知患者PCR區(qū)域5/9/20248HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件基礎HPV基因分型實驗室布局（2）

每個區(qū)域必須有其專用的工作服及一次性手套；每次操作必須更換；涉及到公用儀器使用，必須注意防止交叉污染，定時使用次氯酸鈉溶液擦洗；5/9/20249HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件實驗室環(huán)境注意事項

工作區(qū)域必須始終保持清潔整齊；所有實驗臺面及地面均應保持清潔；所有實驗廢料及垃圾使用專用垃圾帶裝好后，封口處理；在每次工作前后對工作臺面進行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后開啟紫外燈進行滅菌；5/9/202410HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件實驗室制度及人員配備

有效的臨床結(jié)果嚴格規(guī)章制度并遵守操作人員具有專業(yè)技術知識和經(jīng)驗強烈責任感工作態(tài)度認真細心嚴格遵守HPV基因分型各項工作的標準操作規(guī)程5/9/202411HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件實驗所需儀器HybirMax?醫(yī)用核酸分子快速雜交儀PCR擴增儀超凈工作臺水浴鍋離心機旋渦混合儀微量移液器5/9/202412HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件HPV基因分型檢測試驗項目

——HPV臨床樣本的采集方法及注意事項5/9/202413HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件HPV臨床樣本的采集方法及注意事項標本收集標本保存5/9/202414HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件標本收集檢查前告知病人注意事項：月經(jīng)正常婦女，在月經(jīng)來潮后10～18天為最佳檢查時間。檢查前48小時內(nèi)不要作陰道沖洗，不要用避孕藥膏等陰道內(nèi)用藥物。檢查前48小時最好不要行性生活。檢查前不進行醋酸或碘液涂抹。

5/9/202415HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件標本收集

步驟－

先脫掉褲子，然后按醫(yī)生指示仰臥于一張檢查床上。

步驟二由醫(yī)生以窺陰器或陰道張開器暴露宮頸。然后使用專用的HPV采樣刷置于宮頸口采集標本。（最好在取樣前先用棉簽擦去宮頸分泌物）5/9/202416HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件標本收集步驟四慢慢取出宮頸刷，將其放入標有病人編號的取樣管中，取樣管內(nèi)已加有專用細胞保存液，折斷其刷頭入管中，擰緊瓶蓋。步驟三將專用宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉(zhuǎn)5圈。

5/9/202417HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件標本保存樣本一經(jīng)采集，則應盡可能快的送至檢測實驗室。如若不能馬上送檢樣本，請于4℃保存，請在2個星期之內(nèi)進行檢測。5/9/202418HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件標本收集標準收集中注意事項：使用凱普專用取樣器及保存液，可抑制細菌生長，保持DNA完整性。樣本收集中為保留足夠的宮頸細胞標本，注意切勿將宮頸刷頭丟棄。宮頸保存系統(tǒng)包裝打開后，必須立即進行采樣，并連同刷頭置于取樣管中。如果同時進行細胞學檢查，應先采細胞學樣品。宮頸刷頭折斷、試驗取樣時，請小心操作，切忌大力震蕩取樣管，造成試劑及樣本濺出影響檢測結(jié)果或造成污染。取樣管上標示的名稱須與患者一一對應。取樣后，切記擰緊取樣管管蓋。5/9/202419HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件HPV基因分型檢測試驗項目

——臨床試驗操作注意事項5/9/202420HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件因操作欠規(guī)范導致的問題分析5/9/202421HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件移液器：①嚴禁大力來回擰動；②嚴禁調(diào)至容量之外使用；③第二檔為排空檔，不得作吸取之用；④吸頭應浸入液面2—3mm處吸??；⑤嚴禁將有液體的移液器平放或倒置；⑥混勻沉淀時，將吸頭緊貼于沉淀上方管壁，反復吸取液體，將沉淀反復混勻，溶解；⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染隨時清洗。5/9/202422HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件（二）實驗室布局不合理引起的污染問題1、樣品處理不進行隔離，樣品中各種核酸片段均會通過空氣進行傳播。2、PCR結(jié)果檢測實驗室和其它實驗室在一起，會出現(xiàn)嚴重的擴增子污染。3、儀器設備及工作服等（尤其是加樣器）公用，也會造成嚴重污染。4、實驗室操作垃圾（吸頭、離心管、樣品杯等）亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實驗室污染。

5/9/202423HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件（三）PCR操作中存在問題分析1.陽性變陰性2.陰性變陽性3.PCR結(jié)果不穩(wěn)定5/9/202424HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件1.陽性變陰性

(1)有些陽性病人，經(jīng)過PCR檢測后為陰性，可能有兩種情況：一是采集標本方法或部位不正確，二是如果病人取樣部位病原體消失，需根據(jù)病人的病理情況采樣。5/9/202425HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件(2)標本保存不當，可引起PCR失敗。收集的標本亂放（未放冰箱），病原體的破裂，檢測的核酸降解，失去了PCR檢測的模板或造成標本污染。5/9/202426HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件2.陰性變陽性

常見的原因有以下5點：

5/9/202427HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件①加樣器通道易形成氣溶膠，造成加樣器通道污染，可通過使用有濾篩的吸頭避免污染

（將模板DNA加入PCR系統(tǒng)時，注意切勿形成噴霧，后者有可能污染別的反應，所有并非即用管都應蓋嚴）。

5/9/202428HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件②打開標本管蓋引起樣品飛濺

（打開前須瞬間離心）③操作時手套引起的交叉污染

（拿過模板DNA管后應更換手套）5/9/202429HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件④不明原因引起公用試劑污染

（必須設置一個不含模板DNA但含PCR系統(tǒng)中所有其他成分的對照反應。這一對照管須在準備好所有其他PCR以后才進行吸加）。⑤實驗室污染

5/9/202430HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件

臨床試驗操作注意事項

實驗室建設方面HPV分型檢測試驗操作方面

DNA提取

PCR擴增導流雜交(詳見各項操作的SOP）5/9/202431HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——實驗室建設方面一、實驗室分獨立房間操作:

樣本儲存區(qū)（與試劑儲存分開）PCR前區(qū)域(試劑貯存及準備區(qū),樣本處理區(qū)) PCR后區(qū)域(PCR擴增產(chǎn)物分析區(qū))

儀器及耗材獨立使用，切忌前后區(qū)域交叉！試驗工作服及手套獨立二、單一工作流程:PCR前區(qū)域PCR后區(qū)域三、實驗室環(huán)境（防止污染、保持清潔整齊、嚴格制定及執(zhí)行各項規(guī)章）四、試劑管理及標本管理試劑按要求溫度貯存、注意有效期，使用過的試劑擰緊歸類放好；樣本清楚標記好樣本號、與試劑分開貯存，使用過的樣本歸類放好五、以謹慎的態(tài)度對待，并清楚記錄實驗結(jié)果及一些突發(fā)性問題；5/9/202432HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——DNA提取

使用移液器吸取臨床樣本時，避免移液槍頭碰到樣本管壁。所用移液槍頭均為一次性用品，切忌重復使用；防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染

正確使用移液器5/9/202433HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——DNA提取盡可能使用帶有濾心的移液器槍頭防止形成氣溶膠污染實驗室環(huán)境防止樣本DNA污染移液器槍管5/9/202434HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——DNA提取DNA提取操作步驟注意事項：加入溶液Ⅰ之前,應確保溶液中沒有沉淀出現(xiàn)!

以免影響提取效率.加入臨床樣本時,最好在超凈工作臺前操作,且將用過的槍頭打入到盛有10％次氯酸鈉的廢液瓶中,以免樣品交叉污染,影響以后的PCR檢測.在煮沸樣品時,切記不要讓沸水濺入到樣品管中!建議水沸騰后調(diào)低火力.每次去上清時,盡量去干凈,特別是第3步驟,以免影響提取效果.在做PCR之前,最好將提取的樣品離心5分鐘,取樣時盡量不要將槍尖碰到管底的沉淀。5/9/202435HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——PCR擴增正確使用移液槍防止造成樣本交叉污染防止造成試劑被污染5/9/202436HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——PCR擴增盡可能使用帶有濾心的長頭移液器槍頭防止形成氣溶膠防止樣本DNA交叉污染防止樣本污染試劑5/9/202437HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——PCR擴增防止造成試劑被污染移液槍頭均為一次性用品,切忌重復使用移液槍頭盡可能為帶有濾芯每個區(qū)域必須用專用儀器、耗材。進入不同房間必須穿專用工作服及帶手套，離開時必須先脫去工作服及手套。PCR后操作區(qū)域房間內(nèi)的所有耗材及儀器均不能與PCR前區(qū)域混合使用。使用前后均以次氯酸消毒液清理。5/9/202438HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——PCR擴增HPV58HPV18HPV16PCR操作不當造成污染：5/9/202439HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗操作注意事項

——導流雜交雜交及雜交后清洗溫度（45

C

）。每次清洗膜后，抽液干凈。確保PCR產(chǎn)物變性成功。遵守封阻反應溫度及時間、酶標反應時間及顯色反應時間，確保雜交結(jié)果背景正常。正確使用移液器，移液槍及槍頭專用。5/9/202440HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件HPV基因分型檢測試驗項目

——臨床試驗結(jié)果分析及常見問題

5/9/202441HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題HPV陽性正常結(jié)果HPV陰性正常結(jié)果5/9/202442HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題一、雜交結(jié)果中IC點不清楚，同時陽性點也不清楚或比較淡；可能原因：①雜交溫度控制不當，出現(xiàn)非特異性雜交點；

②DNA樣本中有對PCR反應的抑制物質(zhì)，影響了PCR擴增的效率；

③確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。④病人樣本是否取樣前是否違反了取樣要求？將DNA樣本稀釋10倍后，重新PCR擴增及雜交反應可解決。5/9/202443HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題二、雜交結(jié)果中，在雜交膜上既無IC點，也沒有HPV分型陽性點顯色；可能原因：①可能是因為DNA模板中存在抑制PCR反應的抑制物質(zhì)，首先,通過抽提得到的DNA的純度對PCR反應會有很大影響,所以必須在做PCR模板的時候?qū)⑵湎♂審亩档虳NA溶液中抑制劑的濃度,使得PCR反應能正常進行，在一家新的醫(yī)院開始試驗的時候均需要摸索本院樣本自身的特點。②或者所取樣本，不符合凱普HPV分型檢測說明書中對樣本的要求，樣本之前經(jīng)過碘染色或者病人使用了陰道沖洗藥物，均會對PCR反應產(chǎn)生抑制。③確保PCR產(chǎn)物完全變性成單鏈，如有必要，在使用前再次變性PCR產(chǎn)物。如果這些情況的時候，建議對樣本稀釋10倍重新PCR，然后雜交，結(jié)果仍然不成功的情況下，建議按照凱普說明書要求重新取樣檢測。5/9/202444HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題402721403022403040403078稀釋

1:10DNA模板重復PCRHPV58HPV18IC(+)HPV51弱

IC,HPV525/9/202445HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題三、雜交結(jié)果中IC點沒有，同時陽性點淡或不清楚；可能原因：①樣本中含有抑制PCR反應的物質(zhì)；②樣本中HPVDNA濃度較低，同樣本中含有抑制PCR反應的物質(zhì)；③病人樣本不符合凱普分型試驗要求，樣本本身為陰性結(jié)果，但因為樣本中有抑制PCR反應的物質(zhì)，同時操作人員對雜交溫度又控制不當，出現(xiàn)非特異性雜交點；

建議增加用于擴增DNA濃度，重新PCR擴增及雜交反應。5/9/202446HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題四、IC點弱或者沒有，但HPV分型陽性點顯色正?？赡茉颍孩儆捎贗C和HPVDNA之間存在競爭，高濃度的HPVDNA可能會對IC點的擴增反應產(chǎn)生競爭性抑制，此現(xiàn)象出現(xiàn)時如HPV分型點顯色正常，則認為分型結(jié)果正確。5/9/202447HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題六、Biotin（生物素）點不顯色可能原因：①請確認所使用試劑是否仍在有效期內(nèi)。尤其是酶標液及顯色液是否按要求使用及儲存。②確定實驗操作是否嚴格按照說明書進行、且試劑是否按要求保存使用。5/9/202448HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題七、陰性對照顯現(xiàn)HPV分型陽性點可能原因：①PCR試劑可能被污染，取5

lPCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。②重復進行PCR及雜交試驗。5/9/202449HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題八、雜交膜有很高的背景可能原因：①可能由于封閉不足，使未結(jié)合的酶標殘留在膜上。確保封閉液完全覆蓋整個雜交膜。②也可能因為沒有完全將未結(jié)合的試劑清洗干凈，請確保在顯色過程中雜交膜充分清洗，無剩余殘留液體。5/9/202450HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題九、封阻液抽不動可能原因：①仔細觀察封阻液是否有絮狀微生物或澄淀，如果有則證明封阻液有發(fā)霉跡象，是由于操作中沒有使用滅菌槍頭而造成的。

重新購買封阻液，同時確保試驗中使用已滅菌的移液槍頭5/9/202451HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題十、什么時候需要做陽性及陰性對照①當一個新的醫(yī)院，一個新的地方開展試驗的時候，或更換試驗地點的時候，需要進行陰陽性對照試驗；②當使用的檢測試劑批次改變的時候需要做1次陰陽性對照；③當雜交結(jié)果出現(xiàn)令人疑惑，比如多個樣本的雜交結(jié)果一樣，或者雜交結(jié)果出現(xiàn)過多的多重感染，以及雜交試驗后出現(xiàn)許多無IC點及陽性雜交點的結(jié)果等情況下，需要使用同批試劑進行陰陽性對照試驗以驗證問題所在；5/9/202452HPV基因分型檢測試劑盒常見問題課件臨床試驗結(jié)果分析及常見問題十一、導流雜交試驗中的污染主要會出現(xiàn)在那一步中，應該怎樣防范？①首先，污染情況主要由PCR操作中樣本DNA的交叉而產(chǎn)生；對于此種情況，應嚴格按照SOP操作，確保PCR加樣的試驗器材均為專用，特別是移液槍和槍頭。②其次，雜交結(jié)果中出現(xiàn)的比較弱的雜交點不是污染造成，而是雜交