病毒的培養(yǎng)技術(shù)（動(dòng)物微生物課件）

一病毒的分類二病毒的特點(diǎn)三病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成

病毒的概念病毒的大小與形態(tài)四病毒的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成五你對(duì)病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)了解嗎?3種病毒在電子顯微鏡放大數(shù)十萬(wàn)倍后再經(jīng)計(jì)算機(jī)處理而得到的圖象艾滋病病毒新冠病毒禽流感病毒各種形態(tài)病毒的電鏡照片細(xì)菌過(guò)濾器電子顯微鏡病毒的發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒伊凡諾夫斯基，俄羅斯著名科學(xué)家，1892年發(fā)現(xiàn)煙草花葉病病源的濾過(guò)性100年前，科學(xué)家們?cè)谘芯繜煵莼ㄈ~病的病因時(shí)，將患花葉病的煙草榨出汁液，通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器將細(xì)菌濾去，再用過(guò)濾后的汁液去感染正常的煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草仍然患病。于是，他們認(rèn)為煙草花葉病是由一種比細(xì)菌還小的生物引起的，但人們?nèi)匀徊徽J(rèn)識(shí)它的“廬山真面目”，直到20世紀(jì)30年代，科學(xué)家發(fā)明了電子顯微鏡，才看到了它的真面目，并把這種生物叫做“濾過(guò)性病毒”，這就是我們所說(shuō)的病毒。病毒（Virus）一、概念：病毒是一類體積微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只含一種類型核酸(RNA或DNA），必須在活的易感細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制的方式進(jìn)行增殖的非細(xì)胞型微生物。完整成熟的具有感染性的病毒顆粒稱病毒體，具有典型的病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)和傳染性。煙草花葉病毒噬菌體禽流感病毒二、病毒的分類（按寄生宿主）：

1.植物病毒2.動(dòng)物病毒3.細(xì)菌病毒1.植物病毒：專門寄生在植物細(xì)胞內(nèi)煙草花葉病毒寄生于菜青蟲的病毒2.動(dòng)物病毒：寄生于無(wú)脊椎動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)的病毒寄生于脊椎動(dòng)物和人體細(xì)胞內(nèi)的病毒狂犬病毒-寄生于人、畜禽流感病毒-寄生于人、禽3.細(xì)菌病毒：寄生在細(xì)菌等生物細(xì)胞里的病毒，也叫噬菌體。1.個(gè)體微小以納米（nm）為測(cè)量單位，可通過(guò)細(xì)菌濾器；必須在電子顯微鏡下放大幾萬(wàn)至幾十萬(wàn)倍后方可觀察。細(xì)菌濾器病毒可以通過(guò)細(xì)菌濾器濾膜，而大于濾膜孔徑的細(xì)菌等顆粒不能通過(guò)電子顯微鏡三、病毒的特點(diǎn)2.結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單病毒無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，僅含有一種類型核酸（RNA或DNA）。動(dòng)物細(xì)胞：有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜)病毒：無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(核酸)三、病毒的特點(diǎn)3.專性細(xì)胞內(nèi)寄生病毒必須寄生在活細(xì)胞內(nèi)，利用宿主的代謝系統(tǒng)和能量，以復(fù)制方式增殖，具有嚴(yán)格的宿主特異性。eg.新城疫病毒主要危害雞、珠雞和火雞，強(qiáng)毒株可使雞群全群毀滅新城疫病毒三、病毒的特點(diǎn)4.對(duì)抗生素不敏感由于病毒無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝系統(tǒng)，對(duì)抗生素不敏感。干擾素可抑制病毒增殖。三、病毒的特點(diǎn)抗生素犬用干擾素病毒的大小差別懸殊(20～300nm),球型病毒用直徑長(zhǎng)短表示，其他形狀病毒以長(zhǎng)度*寬度表示。最大的痘病毒約300nm；最小的脊髓灰質(zhì)炎病毒約20～30nm。四、病毒的大小與形態(tài)--1.病毒的大小病毒具有多形性，一般呈球形或桿形，少數(shù)為子彈形、磚形或蝌蚪形。例如：腺病毒、冠狀病毒皰疹病毒為球形；煙草花葉病毒為桿形狂犬病毒為子彈形痘病毒為磚形噬菌體為蝌蚪形四、病毒的大小與形態(tài)--2.病毒的形態(tài)球形病毒桿形病毒蝌蚪形病毒人和動(dòng)物病毒多為球形；植物病毒多數(shù)為桿形；細(xì)菌病毒多為蝌蚪形。五、病毒的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成基本結(jié)構(gòu)核衣殼

病毒體核心衣殼輔助結(jié)構(gòu)包膜病毒粒子是指一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能完整的病毒顆粒。病毒粒子主要由核酸和蛋白質(zhì)組成。核酸位于病毒粒子的中心，構(gòu)成了它的核心，蛋白質(zhì)包圍在核心周圍，構(gòu)成了病毒粒子的衣殼。核酸和殼體合稱為核衣殼。無(wú)包膜病毒或裸露病毒衣殼核酸包膜刺突包膜病毒裸露病毒包膜病毒包膜刺突最簡(jiǎn)單的病毒就是裸露的核衣殼，稱為裸露病毒或無(wú)包膜病毒；某些病毒的核衣殼外，還有一層包膜結(jié)構(gòu)，稱為包膜病毒。

1.核心核酸組成各種病毒的核心。一種病毒只含有一種類型的核酸（DNA或RNA）；噬菌體大多含DNA，植物病毒大多數(shù)含RNA。核酸可以是單股的，也可以是雙股的；可以是線狀的，也可以是環(huán)狀的。功能：病毒核酸（基因組）儲(chǔ)存病毒的遺傳信息，控制其遺傳變異、增殖和對(duì)宿主的感染性等。核酸五、病毒的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成2.衣殼指圍繞病毒核酸并與之緊密相連的蛋白質(zhì)外殼，它由許多殼粒組成。殼粒是指在電子顯微鏡下可以辨認(rèn)的組成殼體的亞單位，由一個(gè)或多個(gè)多肽分子組成。衣殼功能：保護(hù)病毒核酸免受核酸酶的破壞；無(wú)包膜病毒體的衣殼蛋白可吸附于易感細(xì)胞表面，協(xié)助病毒侵入細(xì)胞引起感染；具有免疫原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。核酸衣殼殼粒五、病毒的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成衣殼類型：根據(jù)殼粒的排列方式不同，病毒的衣殼有3種對(duì)稱型結(jié)構(gòu)。①二十面體對(duì)稱型②螺旋對(duì)稱型③復(fù)合對(duì)稱型螺旋對(duì)稱型復(fù)合對(duì)稱型二十面體對(duì)稱型腺病毒①二十面體立體對(duì)稱:外圍的殼粒排列成二十面體對(duì)稱型，外觀為球狀，實(shí)際為20面體。eg.腺病毒②螺旋對(duì)稱:衣殼粒一個(gè)接一個(gè)地呈螺旋對(duì)稱排列而成，核酸存在于螺旋狀溝中。eg.煙草花葉病毒核酸蛋白質(zhì)衣殼煙草花葉病毒

③復(fù)合對(duì)稱：頭部呈球形，為20二十面體立體對(duì)稱，尾部是一管狀結(jié)構(gòu)，為螺旋對(duì)稱。eg.大腸桿菌T系噬菌體（蝌蚪形）20面體立體對(duì)稱型螺旋對(duì)稱型核心(黃色部分)衣殼(棕色\綠色部分)噬菌體（電鏡）3.包膜部分病毒的衣殼外還包繞的一層囊膜樣結(jié)構(gòu)，稱為包膜。包膜組成：由宿主細(xì)胞膜或核膜（雙層脂質(zhì)）組成，鑲嵌有糖蛋白組成的丁狀突起，即刺突。包膜包膜子粒或刺突五、病毒的結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成3.包膜包膜具有雙重性：①宿主細(xì)胞膜性：病毒從細(xì)胞內(nèi)向外釋放而獲得宿主細(xì)胞膜或核膜成分(脂質(zhì))。②病毒蛋白特性：包膜的蛋白質(zhì)由病毒基因編碼，常位于病毒體的表面，構(gòu)成剌突。3.包膜有包膜的病毒稱為包膜病毒。例如：新城疫病毒、冠狀病毒3.包膜包膜功能：①保護(hù)核衣殼；②與病毒的吸附、親嗜性有關(guān)；eg.冠狀病毒通過(guò)包膜上的特殊結(jié)構(gòu)識(shí)別并附著于黏膜細(xì)胞③包膜刺突具有免疫原性。病毒的雞胚接種病毒培養(yǎng)的宿主：本動(dòng)物（例如：豬瘟病毒-豬）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、雞胚體外培養(yǎng)的活細(xì)胞在本試驗(yàn)中，采用的是雞胚接種、培養(yǎng)新城疫病毒。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解雞胚的基本結(jié)構(gòu)與功能；

掌握新城疫病毒的雞胚尿囊腔接種法。

二、試驗(yàn)原理

雞胚為活的動(dòng)物機(jī)體，組織分化程度低，病毒易于增殖，可選擇不同的日齡和接種途徑，感染病毒的組織和液體中含大量病毒。

尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫病毒等的接種和培養(yǎng)。進(jìn)入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到尿囊液中。通過(guò)尿囊腔接種途徑可獲得大量的病毒。二、試驗(yàn)原理

雞胚為活的動(dòng)物機(jī)體，組織分化程度低，病毒易于增殖，可選擇不同的日齡和接種途徑，感染病毒的組織和液體中含大量病毒。

尿囊腔接種常用于流感病毒、新城疫病毒等的接種和培養(yǎng)。進(jìn)入尿囊腔的這些病毒，能夠在尿囊的內(nèi)胚層細(xì)胞中大量繁殖，隨后釋放到尿囊液中。通過(guò)尿囊腔接種途徑可獲得大量的病毒。

三、材料

雞新城疫病毒（NDV）、雞胚（9-11日齡）、照蛋燈、蛋座、酒精棉球、碘酊棉球、酒精燈、打孔器、1mL注射器、石蠟、廢物缸、孵卵箱四、雞胚的結(jié)構(gòu)與功能卵殼上有細(xì)孔，進(jìn)行氣體交換殼膜使氣體分子和液體分子在內(nèi)外兩方面進(jìn)行交換。氣室呼吸和調(diào)節(jié)壓力絨毛尿囊膜起胚胎呼吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過(guò)卵殼孔而進(jìn)行的。尿囊腔胚胎的排泄器官，內(nèi)含有尿囊液，初為透明液體，以后尿囊液中尿酸鹽迅速增加，胚胎發(fā)育到第12-13天后，尿囊液開(kāi)始變得混濁。在本試驗(yàn)中，病毒的雞胚接種部位在尿囊腔。羊膜與羊膜腔其中盛有羊水，胎體浸泡于其中卵黃在胚胎發(fā)育早期供給雞胚營(yíng)養(yǎng)。卵白在胚胎發(fā)育晚期供給雞胚營(yíng)養(yǎng)。10日齡雞胚的結(jié)構(gòu)五、受精卵的選擇最好是來(lái)自SPF雞群，以降低母源抗體的影響。受精卵的殼最好是白色的。受精卵必須新鮮，保存在5-20℃不要超過(guò)10天，保存一個(gè)月的受精卵，孵化率將近于零。六、雞胚孵育條件孵卵箱內(nèi)的溫度應(yīng)保持在37.5-38.5℃相對(duì)濕度：50%-60%必須保證具有充分的新鮮空氣流通，特別是在孵化5-6天以后。從孵育后第3天開(kāi)始，每天翻蛋一次。七、雞胚生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程雞胚從第1天開(kāi)始孵育至第21天出殼，胚胎發(fā)育過(guò)程如圖所示。孵育至第13天時(shí)，雞胚開(kāi)始長(zhǎng)毛。在本試驗(yàn)中，使用的是9-11日齡的雞胚。在發(fā)育的早期，雞胚不易辨認(rèn)，要到4－5天后才容易看見(jiàn)。因此，檢卵要在孵育4－5天后進(jìn)行，每天用照蛋燈檢卵一次，檢查雞胚的存活情況?；钆撸夯畹碾u胚絨毛尿囊膜界線較明顯，上面的血管清晰可見(jiàn)、成網(wǎng)狀，可看到明顯的胚胎自主運(yùn)動(dòng)。死胚：血管模糊、變細(xì)、折斷脫落，成淤血帶或淤血塊，沒(méi)有胚動(dòng)。八、照蛋檢卵發(fā)育至第5天的雞胚發(fā)育至第4天的雞胚活胚：血管清晰九、雞胚尿囊腔接種新城疫病毒操作步驟1、選用9-11日齡的雞胚，在黑暗環(huán)境下用照蛋燈檢查雞胚活力。活胚：發(fā)育良好的雞胚可見(jiàn)清晰的血管和雞胚暗影，較大雞胚還可見(jiàn)到胚動(dòng)。死胚：血管昏暗模糊成淤血帶或淤血塊，沒(méi)有胚動(dòng)。

2、在照蛋燈的燈光下用鉛筆畫出氣室范圍，并在將要接種的部位做好記號(hào)。注意：接種部位須避開(kāi)大血管，在氣室邊緣靠上方0.5cm左右位置。

圖中黑色部分即尿囊腔，注射器針頭從接種部位垂直插入尿囊腔內(nèi)，注入病毒液。九、雞胚尿囊腔接種新城疫病毒操作步驟3、用酒精棉擦拭蛋胚，置于消過(guò)毒的蛋托上。4、用碘伏和酒精消毒接種和氣室部位。先用碘伏棉球消毒，1min后用酒精棉球消毒。5、將打孔器灼燒滅菌，稍冷后在接種部位打一小孔。注意：打孔器打孔時(shí)不能穿透蛋殼膜，避免造成污染。6、將裝有新城疫病毒液的注射器沿小孔插入針頭的三分之二左右，注入0.2ml病毒接種物。7、用石蠟封口，并置孵卵箱中孵育（溫度37℃，相對(duì)濕度50%-60%）。8、每天翻卵并檢卵一次，24h內(nèi)死亡者廢棄；24h之后死亡的雞胚標(biāo)記好死亡時(shí)間，如48h、64h、72h。將死亡的雞胚置于4℃冰箱過(guò)夜，待收毒。1.用于病毒培養(yǎng)的系統(tǒng)主要有哪些？2.簡(jiǎn)要說(shuō)明雞胚的結(jié)構(gòu)及各部分結(jié)構(gòu)的功能。3.如何區(qū)分死胚、活胚？4.用雞胚來(lái)進(jìn)行病毒的培養(yǎng)要注意哪些問(wèn)題?作業(yè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握雞胚收毒方法。

掌握雞胚收毒注意事項(xiàng)。

二、材料

已經(jīng)接種病毒的SPF雞胚；

滅菌好的組織鑷、眼科鑷、眼科剪、帶蓋小青瓶、槍頭（藍(lán)色）；

移液槍（ml）、酒精燈、碘伏棉球、酒精棉球、蛋托、廢物缸，標(biāo)簽紙雞胚收毒三、新城疫病毒接種雞胚后對(duì)雞胚的影響新城疫病毒通過(guò)尿囊腔接種法接種于9-11日齡雞胚之后，若接種的新城疫病毒是強(qiáng)毒株，雞胚在接種后30-60h死亡；若接種的是弱毒株，雞胚在接種后3-6d死亡。以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以頭部、足趾、翅膀出血最為明顯。四、收毒前雞胚處理--雞胚冷置收獲前雞胚須氣室朝上置于4℃冰箱6h或過(guò)夜，但不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起散黃）。如急于收獲亦可置-20℃冰箱1h左右。預(yù)冷的目的：將雞胚凍死，使血液凝固，防止收毒過(guò)程中出血。注意：收毒時(shí)若有出血，會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞與尿囊液中的病毒發(fā)生凝集反應(yīng)，造成病毒滴度下降。1.雞胚消毒用酒精棉擦拭蛋胚，將雞胚鈍端向上置于消過(guò)毒的蛋托上。將雞胚氣室上方卵殼先用碘伏消毒，再用酒精棉脫碘。五、收毒操作步驟2.去除氣室上方蛋殼首先用大鑷子將消毒好的雞胚氣室一側(cè)的蛋殼敲破，用眼科剪沿著氣室邊緣減除蛋殼，注意不要戳破蛋殼膜，