HYT 229-2018 海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)確證方法

海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)確證方法2018-02-13發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國家海洋局第三海洋研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由海洋生物資源保護(hù)與開發(fā)分技術(shù)委員會(SAC/TC283/SC6)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：國家海洋局第三海洋研究所、國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計量中心。1海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)確證方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)的確證程序、確證內(nèi)容、確證方法和要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海洋生物活性物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品結(jié)構(gòu)的確證。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。海洋生物活性物質(zhì)marinebioactivematerial對人、動物、植物和微生物的生命活動有影響的海洋生物組分或代謝產(chǎn)物，來源于海洋生物或其衍生物且分子量小于1500Da。結(jié)構(gòu)確證structureconfirmation經(jīng)過物理、化學(xué)的方法，準(zhǔn)確無誤地確證目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)過程。波譜分析spectrumanalysis主要是以光學(xué)理論為基礎(chǔ)，以物質(zhì)與光相互作用為條件，建立物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與電磁輻射之間的相互關(guān)系，從而進(jìn)行物質(zhì)分子幾何異構(gòu)、立體異構(gòu)、構(gòu)象異構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)分析和鑒定的方法。對照品referencesubstance用于鑒別、檢查、含量測定和校正檢定儀器性能的對照物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)樣品referencematerial;RM一種或多種規(guī)定特性足夠均勻和穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測量過程的預(yù)期用途。如果一對分子的組成和原子的排列方式完全相同，但如同左手和右手一樣互為鏡像，在三維空間里不能重疊，這對分子互稱手性對應(yīng)異構(gòu)體，有手性對應(yīng)異構(gòu)體的化合物稱為手性化合物。3結(jié)構(gòu)確證3.1結(jié)構(gòu)確證程序3.1.1一般目標(biāo)化合物應(yīng)按以下程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證：a)質(zhì)譜或高分辨質(zhì)譜確定目標(biāo)化合物的分子量、分子式，根據(jù)碎片峰及裂解規(guī)律推導(dǎo)部分結(jié)構(gòu)信息；b)核磁共振譜的氫譜、碳譜和其他的原子譜，以及相關(guān)的二維譜，確定目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)；2c)紅外光譜確定目標(biāo)化合物的官能團(tuán)；e)元素分析確定目標(biāo)化合物各元素的組成比例，推導(dǎo)分子式及純度信息。3.1.2手性化合物除按3.1.1規(guī)定的程序進(jìn)行分析外，還應(yīng)按以下其中一種程序確定目標(biāo)化合物的手性構(gòu)型：a)圓二色譜確定目標(biāo)化合物的立體構(gòu)型；b)比旋度確定目標(biāo)化合物的立體構(gòu)型。3.2.1.1對于一般目標(biāo)化合物而言，可以先采用HPLC法在相同條件下進(jìn)行分析，通過保留時間比對，對化合物進(jìn)行初步定性。或者將一般目標(biāo)化合物和對照品在完全相同條件下進(jìn)行核磁共振譜、質(zhì)譜等譜圖的比對，若兩者間的譜圖完全一致，則可確定目標(biāo)化合物與對照品為同一物質(zhì)。3.2.1.2對于目標(biāo)手性化合物而言，除了將目標(biāo)手性化合物和對照品在完全相同條件下進(jìn)行核磁共振譜、質(zhì)譜的比對之外，還需要進(jìn)行圓二色譜比對或比旋度數(shù)值比對，若目標(biāo)手性化合物的核磁共振譜數(shù)據(jù)、質(zhì)譜數(shù)據(jù)、圓二色譜、比旋度數(shù)值或X-Ray單晶衍射的Flack值與對照品的數(shù)據(jù)完全一致，則可確定目標(biāo)手性化合物與對照品為同一手性化合物。3.2.2.1對于一般目標(biāo)化合物應(yīng)按照3.1的要求對目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。一般目標(biāo)化合物的質(zhì)其分子結(jié)構(gòu)，并與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)取得一致。3.2.2.2對于手性化合物，應(yīng)按照3.1.2的要求對目標(biāo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。其質(zhì)譜、核磁共振譜、紅外征信息，方可確定其分子結(jié)構(gòu)，并與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)取得一致。3.3化合物其他信息確證4海洋生物活性物質(zhì)化合物的結(jié)構(gòu)確證方法按目標(biāo)化合物的已知性質(zhì)選擇離子源：a)對于極性強(qiáng)的目標(biāo)化合物，如肽，糖，核苷等，宜采用ESI(電噴霧電離，Electrospraylonization)電離源，選擇正離子模式或負(fù)離子模式；b)對于低極性熱穩(wěn)定的目標(biāo)化合物，宜采用APCI(大氣壓化學(xué)電離源，AtmosphericPressureChemicallonization)電離源，選擇正離子模式或負(fù)離子模式；c)對于易于氣化的目標(biāo)化合物，宜采用EI(電子轟擊離子源，Electronimpactionsource)電d)對于高極性、大分子量、難揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差的目標(biāo)化合物，宜采用FAB(快原子轟擊電離源，F(xiàn)astatombombarbmentionization)、FD(場解吸電離源，F(xiàn)ielddes34.2核磁共振光譜分析應(yīng)使用不低于400MHz的NMR儀。按目標(biāo)化合物的已知性質(zhì)，選擇1HNMR,3CNMR,DEPT,H-HCOSY,HMQC,HMBC和NOE中的一種或多種譜圖進(jìn)行核磁共振光譜分析。供氘交換后的'H譜。b)通過1HNMR譜獲得目標(biāo)化合物的氫原子化學(xué)位移值和質(zhì)子個數(shù)。c)通過13CNMR譜獲得目標(biāo)化合物的碳原子化學(xué)位移值和碳原子個數(shù)。d)通過雜原子譜獲得目標(biāo)化合物的雜原子化學(xué)位移值和雜原子個數(shù)。e)復(fù)雜結(jié)構(gòu)化合物，當(dāng)一般的1H和13C譜不能對每個質(zhì)子和碳原子明確歸屬時，或圖譜峰過于擁擠，應(yīng)考慮采用合適的其他技術(shù)確證，尤其是二維譜的測定和結(jié)構(gòu)解析，如1H譜中的各種去屬，或在'H譜和13C譜數(shù)據(jù)表中增加相應(yīng)的欄目列出(詳見附錄A)。f)對于復(fù)雜結(jié)構(gòu)的化合物，需要增加HMBC和NOE數(shù)據(jù)；對于核磁波譜無法確定的化合物，需4.3紅外吸收光譜分析固體樣品采用溴化鉀壓片法，液體樣品采用液膜法。對具有足夠均勻的一種或多種化學(xué)的、物理的、生物學(xué)的、工程技術(shù)的或感官的性能特征圖譜解析時，應(yīng)盡可能歸屬每一官能團(tuán)的特征譜及指紋譜，幾何構(gòu)型與立體構(gòu)象信息亦應(yīng)有一定解析。對于在200nm～800nm有紫外-可見吸收的目標(biāo)化合物，應(yīng)測定其最大吸收峰對應(yīng)的波長，最大吸收吸光度值應(yīng)小于1,并計算lge。對于同一物質(zhì)，不論濃度大小如何，最大吸收峰對應(yīng)的波長(最大4.5熔點或折光率分析4.5.1對于固體性狀的目標(biāo)化合物，應(yīng)測定其熔點。測定熔點時，在接近熔點前，升溫速率應(yīng)控制在每分鐘0.5℃~1.5℃。供試品開始局部液化時(或開始產(chǎn)生氣泡時)的溫度作為初熔溫度；供試品固體全部液化時的溫度作為全熔溫度。遇有固體消失不明顯時，應(yīng)以供試品分解物開始膨脹上升時的溫度作為全熔溫度。某些目標(biāo)化合物無法分辨其初熔、全熔時，可以將其發(fā)生突變時的溫度作為熔點。對融解后又固化并在更高溫度時再次出現(xiàn)融解的物質(zhì)，應(yīng)記錄雙熔點現(xiàn)象。對于未到熔點就出現(xiàn)升華的物質(zhì)，應(yīng)密封在盡可能小體積的熔點測定管中。4.5.2對于液體性狀的目標(biāo)化合物，應(yīng)測定其折光率。測定折光率時，滴加樣品應(yīng)注意切勿使滴管尖端直接接觸鏡面，以防造成割痕。滴加液體要適量，分布要均勻，對于易揮發(fā)液體，應(yīng)快速測定折光率。測完后，應(yīng)立即擦洗上下鏡面，晾干后再關(guān)閉折光儀。在測定樣品之前，對折光儀應(yīng)進(jìn)行校正。通常先4測純水的折光率，將重復(fù)兩次所得純水的平均折光率與其標(biāo)準(zhǔn)值。記錄折光率時，要注明測定環(huán)境的溫度。4.6元素組成分析或高分辨質(zhì)譜分析采用元素分析法可獲得組成目標(biāo)化合物的元素種類及含量，比較測試結(jié)果與理論結(jié)果差值的大小(一般對于純有機(jī)物而言，偏差一般在千分之三以內(nèi)；對于不穩(wěn)定的油狀有機(jī)物，偏差一般在千分之五以內(nèi)),即可初步判定供試品與目標(biāo)化合物的分子組成是否一致。對于因化合物自身結(jié)構(gòu)特征而難于進(jìn)行元素分析時，在保證高純度情況下可采用高分辨質(zhì)譜方法獲得目標(biāo)化合物元素組成的相關(guān)信息。4.7圓二色譜分析或旋光光譜分析4.7.1對于目標(biāo)手性化合物，可進(jìn)行圓二色譜測定。測定時若有對照品，則將對照品與目標(biāo)手性化合物，在相同圓二色譜條件下，測定并比對譜圖，以確證目標(biāo)化合物的相對構(gòu)型或絕對構(gòu)型。測定時若沒有對照品，則需要查閱與目標(biāo)手性化合物結(jié)構(gòu)相近或相似手性化合物的圓二色譜文獻(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)報道的實驗條件測試目標(biāo)手性化合物的圓二色譜圖，比對譜圖，以間接確證目標(biāo)化合物的相對構(gòu)型或絕對構(gòu)型。4.7.2對于目標(biāo)手性化合物，也可測定其一定濃度下的旋光值。每次測定前應(yīng)以溶劑作空白校正，測定后，再校正1次，以確定在測定時零點有無變動；如第2次校正時發(fā)現(xiàn)零點有變動，則應(yīng)重新測定旋光度。配制溶液及測定時，均應(yīng)調(diào)節(jié)溫度至25℃±0.5℃(或各品種項下規(guī)定的溫度)。供試物質(zhì)應(yīng)配制成澄清的溶液狀態(tài)。如出現(xiàn)渾濁或含有混懸的小粒，應(yīng)予以濾過，并棄去初濾液。表示物質(zhì)的比旋度時應(yīng)注明測定條件。5(資料性附錄)二十二碳六烯酸甲酯(DHA甲酯)結(jié)構(gòu)解析”A.1理化性質(zhì)樣品為淡黃色油狀物，易溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等有機(jī)溶劑，不溶于水。A.2紅外吸收光譜(IR)A.2.1儀器型號：BrukerVERTEX70紅外光譜儀。A.2.2測試條件：KBr壓片法。A.2.3測試結(jié)果：見圖A.1和表A.1。圖A.1DHA甲酯的紅外光譜圖6吸收峰/cm-1基團(tuán)強(qiáng)度√=cH伸縮振動SSyc=0伸縮振動—COO—SSSA.2.4.13013為烯烴中=C—H的伸縮振動。An_20120521_22144(21.494)Cm(2144:21-3934044274294474494694847A.3.4解釋該化合物分子式C??H??O?,分子量理342。測得的準(zhǔn)分子離子峰m/z=343[M+H]+與其分子量相符。除m/z=343外，還可以見到該化合物脫甲氧基C—O—CH?(31amu)的碎片峰(m/z=311),與該化合物含甲氧基的結(jié)構(gòu)相符。A.4高分辨質(zhì)譜DHA甲酯加鈉離子(C??H??O?Na+)的理論精確質(zhì)量數(shù)為365.2457,高分辨質(zhì)譜測得的DHA甲酯加鈉離子精確質(zhì)量數(shù)為365.2453,兩者數(shù)據(jù)一致。A.5核磁共振譜A.5.1儀器型號：Bruker400MHz型核磁共振儀。圖A.3DHA甲酯的'HNMR核磁共振譜圖89圖A.8DHA甲酯的HMBC(局部)譜圖A.5.5解釋化合物DHA甲酯的分子式為C??H??O?,則不飽和度Ω=7。根據(jù)3CNMR,7個不飽和度分別是由12個烯碳CH(6個不飽和度)和1個羰基碳C(1個不飽和度)組成。根據(jù)13CNMR和DEPT譜圖數(shù)據(jù)1HNMR和HMBC譜圖數(shù)據(jù)(詳見表A.2),可以確認(rèn)單重峰δ3.68ppm(s,3H,OCH?)是一個連著羰基的甲氧基—OCH?(HMBC:δ3.68ppm質(zhì)子峰和173.5ppm的酯鍵C峰有耦合)。三重峰δ0.99基(一CH?—CH?)Hz,-22CH?)和五重峰δ2.09ppm(2H,p,J=7.6Hz,-21CH?)相連的乙片段接在烯碳端(HMBC:H??和C?、C2?有耦合，H??和C2o、C?有耦合)。同時，位于ppm(m,12H,6-CH=CH一)的多重峰指認(rèn)為6個—CH=CH一的分子結(jié)構(gòu)片段，經(jīng)詳細(xì)辨認(rèn)其耦合裂分常數(shù)J=7.2Hz,也證實了此雙鍵是順式結(jié)構(gòu)。分子中除去O=C,一OCH?,-CH?一CH?和6個—CH=CH—的分子結(jié)構(gòu)片段，還有7個亞甲基。1HNMR顯示2組多重峰δ2.81～2.87(m,10H,CH?×5)、2.37～2.44(m,4H,CH?×2),由化學(xué)位移和HMBC可以確認(rèn)有5個CH?分別位于五個烯鍵中間，而δ2.37～2.44指認(rèn)為一CH?—CH?—分子片段，且此分子片段與羰基C?有耦合作用，所以它們組成—CH?—CH?—C=O片段。綜上所述，樣品的核磁共振譜圖(1HNMR、13CNMR、DEPT、HMBC)所給出的結(jié)構(gòu)信息與化合物DHA甲酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式相符(如圖A.9所示)。圖A.9