HYT 0319-2021 貝類 脂溶性海洋生物毒素的檢測 液相色譜-串聯質譜法

中華人民共和國海洋行業(yè)標準貝類脂溶性海洋生物毒素的檢測液相色譜-串聯質譜法Shellfish—Determination中華人民共和國自然資源部發(fā)布HY/T0319—2021 I 2規(guī)范性引用文件 3原理 4試劑和材料 5儀器設備 2 37試驗步驟 38結果計算與表述 59精密度 6 6附錄A(資料性)脂溶性海洋生物毒素 7附錄B(資料性)特征離子質量色譜圖 8附錄C(規(guī)范性)脂溶性海洋生物毒素的毒性因子 參考文獻 I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由中華人民共和國自然資源部提出。本文件由全國海洋標準化技術委員會(SAC/TC283)歸口。本文件起草單位：國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心、中國科學院海洋研究所、廈門大學、中國水產科學研究院黃海研究所。1貝類脂溶性海洋生物毒素的檢測液相色譜-串聯質譜法警示——為避免毒素的危害，應戴手套進行操作。移液管及移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液等應在次氯酸鈉溶液(5%)浸泡1h以上以使毒素分解。酸毒素、環(huán)亞胺毒素等11個毒素化合物的液相色譜-串聯質譜檢測方法原理、操作步驟及結果計算等。本文件適用于貝類體中脂溶性海洋生物毒素的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3原理貝類樣品經甲醇提取，堿性條件下水解釋放酯化態(tài)生物毒素部分，用HLB固相萃取柱凈化，液相4試劑和材料4.2甲醇(CH?OH):色譜純。4.5氨水(NH?·H?O):濃度≥25%。4.6氫氧化鈉(NaOH)。4.7鹽酸(HCL):濃度≥36%。4.8氫氧化鈉溶液(2.5mol/L):準確稱取50g氫氧化鈉，用水定容至500mL,室溫保存。4.9鹽酸溶液(2.5mol/L):準確量取104.5mL鹽酸，用水定容至500mL,室溫保存。4.10甲醇溶液(30%):量取30mL甲醇加到70mL水中，混合均勻，室溫，現用現配。4.11甲醇溶液(20%):量取20mL甲醇加到80mL水中，混合均勻，室溫，現用現配。4.12氨水甲醇溶液(0.3%):吸取0.3mL氨水，用甲醇定容至100mL,室溫，現用現配。AZA2、AZA3、GYM、SPX1標準物質純度≥97%,避光保存于一20℃。24.14脂溶性海洋生物毒素標準儲備液：分別吸取適量的各脂溶性海洋生物毒素標準溶液(見4.13),甲醇(見4.2)配制儲備溶液。0.22μm濾膜(見5.12)過濾，一20℃避光保存?zhèn)溆谩８髦苄院Ｑ笊锒舅貥藴蕛湟簼舛确謩e為：OA40ng/mL,DTX140ng/mL,DTX240ng/mL,YTX400ng/mmoYTX400ng/mL,PTX21000ng/mL,SPX1200ng/mL,GYM10ng/mL,AZA1200ng/mL,AZA2100ng/mL,AZA3100ng/mL。4.15脂溶性海洋生物毒素混合標準工作溶液：分別吸取適量的各脂溶海洋生物毒素標準儲備溶液(見混合標準工作溶液(OA、DTX1、DTX2、YTX、homoYTX)。0.22μm濾膜(見5.12)過濾，-20℃避光保存?zhèn)溆?。各脂溶性海洋生物毒素的濃度見?。表1脂溶性海洋生物毒素標準工作溶液組別濃度15負離子5555儀器設備5.1液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源(ESI)。5.2分析天平：感量0.00001g。5.5渦漩振蕩器。5.6離心機。5.7水浴鍋。5.8固相萃取裝置。5.9真空泵。5.11固相萃取柱：基質為含有N-乙烯吡咯烷酮聚合物的吸附劑，填料質量為30mg,體積為1mL,或者相當。36樣品用清水將貝類外表清洗干凈。切開閉殼肌打開貝殼，用蒸餾水淋洗貝類內部以清除泥沙和其他雜物，取出貝肉置于孔徑約2mm的金屬篩網上瀝水5min。為保證樣品的均勻性，至少取100g貝肉用勻質機勻漿30min,充分混勻。7試驗步驟稱取2.00g貝類組織勻漿于具塞離心管中。加入9.0mL甲醇(見4.2),用渦旋振蕩器混勻1min,3000rpm離心10min,上清液轉移至20mL的容量瓶中，沉渣再加入9mL甲醇(見4.2)重復提取一次，合并兩次提取液，用甲醇(見4.2)定容至20mL,將溶液分成兩份，備用。為了檢測酯化態(tài)的OA組毒素含量。取1.0mL(7.1中的一份)放入色譜進樣瓶中，加入125μL氫氧化鈉溶液(見4.7),用渦旋振蕩器混勻0.5min,置于76℃水浴40min,冷卻至室溫，加入125μL鹽酸溶液(見4.8)中和，渦旋混勻0.5min,0.22μm濾膜過濾后備用。固相萃取柱依次用1.0mL甲醇活化、1.0mL30%甲醇平衡。取1.0mL提取液(7.1中的另一份)加2.8mL水混勻后轉入預處理的固相萃取柱，以約每秒一滴的流速通過固相萃取柱，用1.0mL20%甲醇溶液淋洗，再以1.0mL氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，搖勻后，0.22μm濾膜過濾，液相色譜-串聯質譜測定。按照7.3步驟凈化水解液(見7.2)。7.4樣品測定7.4.1正離子模式液相色譜參考條件正離子模式測定PTX2、AZA1、AZA2、AZA3、GYM、SPX1,液相色譜參考條件如下。b)流動相：A:2mmol/L甲酸銨和50mmol/L甲酸的水溶液；B:2mmol/L甲酸銨和50mmol/L甲酸的95%乙腈水溶液。d)柱溫：25℃。f)流動相梯度：0min～4min,10%B線性變化至80%B;4min～6min,保持80%B,6min~6.5min線性變化至10%B,平衡2.5min。7.4.2負離子模式液相色譜參考條件負離子模式測定OA、DTX1、DTX2和YTX、homoYTX,液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C18,150mm×3.0mm,填料粒徑3.5μm,或相當者。b)流動相：A:0.05%的氨水溶液(pH11);B:含有0.05%氨水的乙腈-水(90/10,體積比)溶液4f)流動相梯度：1min～10min,10%B線性變化至90%B;10min～13min,保持90%B,13min~15min線性變化至10%B,平衡4min。7.4.3質譜條件質譜條件如下：a)離子源：電噴霧離子源。b)掃描模式：正離子和負離子模式。c)檢測方式：多反應監(jiān)測。d)噴霧電壓：4500V。e)毛細管溫度：450℃(正離子模式);600℃(負離子模式)。f)源內碰撞解離電壓：5V。g)霧化氣流速：60L/min。h)輔助加熱氣流速：50L/min。i)離子碎片參數見表2。表2離子對、錐孔電壓和碰撞電壓目標毒素子離子m/zVV5HY/T0319—2021合表3要求。各毒素的特征離子質量色譜圖見附錄B。表3定性測定相對離子豐度的最大允許偏差允許的相對偏差 (1)c;從標準工作曲線中得到的試樣中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度，單位為納克每毫升c。——從標準工作曲線中得到的空白試驗中脂溶性海洋生物毒素溶液濃度，單位為納克每毫升脂溶性海洋生物毒素的毒性因子列于附錄C。樣品中脂溶性海洋生物毒素的含量則按照毒性因69精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。本方法的批內相對標準偏差≤15%,實驗室間相對標準偏差≤37%。本方法各毒素的定量限示于表4中。本方法在0.08μg/kg～200μg/kg添加濃度水平上的回收率為80%～120%。表4脂溶性海洋生物毒素定量限目標毒素定量限7脂溶性海洋生物毒素標準名稱及相關信息見表A中文名稱鰭藻毒素-1原多甲藻酸-1原多甲藻酸-2原多甲藻酸-313-去甲螺旋內酯C8(資料性)特征離子質量色譜圖負離子和正離子模式下脂溶性海洋生物毒素特征離子色譜圖如圖B.1和圖B.2所示。圖B.1負離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標準品溶液特征離子質量色譜圖9離子強度/eps離子強度/eps離子強度/cps圖B.2正離子模式下脂溶性海洋生物毒素混合標準品溶液特征離子質量色譜圖目標毒素毒性因子(r)1pgOA當量/kg11pgPTX當量/kg1pgAZA當量/kg11[1]GB5009.212食品安全國家標準貝類中腹瀉性貝類毒素的測定[2]海洋生物毒素歐盟參考實驗室標準