高中生物3.2基因工程的基本操作程序知識(shí)梳理新人教版選擇性必修3

3.2基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬┠康幕虻暮Y選與獲取1.目的基因概念在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于__________改變受體細(xì)胞性狀__________或__________獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物________等的基因就是目的基因（根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__________編碼蛋白質(zhì)的基因___________）。2.篩選目的基因的方法（1）從相關(guān)的__________已知結(jié)構(gòu)__________和__________功能清晰__________的基因中進(jìn)行篩選。（2）獲取方法①__________人工合成__________②__________基因文庫(kù)中獲取目的基因__________③__________利用PCR獲取和擴(kuò)增__________3.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）PCR的概念：PCR是__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)__________的縮寫(xiě)，是一項(xiàng)根據(jù)______DNA半保留復(fù)制______的原理，在______體外______提供參與DNA復(fù)制的__________各種組分__________與______反應(yīng)條件______，對(duì)___________目的基因的核苷酸序列______進(jìn)行__________大量復(fù)制__________的技術(shù)。①全稱(chēng)：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)___________②原理：___________DNA半保留復(fù)制___________③操作環(huán)境：__________體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）___________④目的：__________對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制___________⑤優(yōu)點(diǎn)：___________可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因___________（2）DNA體內(nèi)復(fù)制的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的_____模板_____4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的_____原料_____解旋酶打開(kāi)DNA雙鏈DNA聚合酶催化合成DNA_____子鏈_____引物使DNA聚合酶能夠從_____引物的3’_____端開(kāi)始連接脫氧核苷酸注：引物是一小段能與______DNA母鏈__________的一段堿基序列__________互補(bǔ)配對(duì)_的______短單鏈核酸__________。（3）DNA體外復(fù)制（PCR）的條件參與的組分在DNA復(fù)制中的作用DNA母鏈提供DNA復(fù)制的_____模板_____4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的_____原料_____引物使DNA聚合酶能夠從_____引物的3’_____端開(kāi)始連接脫氧核苷酸90℃以上高溫打開(kāi)DNA雙鏈（變性溫度）耐高溫的_____DNA聚合酶_____催化合成DNA子鏈緩沖液（含_____Mg2+_____）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的_____DNA聚合酶_____其他不同的溫度_____變性、復(fù)性和延伸_____需要不同溫度注：復(fù)制的原料實(shí)為_(kāi)____dNTP_____（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同時(shí)水解產(chǎn)生能量為合成DNA子鏈提供能量，因此體系中不需要添加_____ATP_____。（4）過(guò)程目的基因DNA__________受熱變性__________后______解為單鏈______，______引物_____與單鏈相應(yīng)______互補(bǔ)序列______結(jié)合；然后以__________單鏈DNA__________為模板在______DNA聚合酶______作用下進(jìn)行___延伸____，即將4種______脫氧核苷酸______加到__________引物的3’__________，如此__________重復(fù)循環(huán)多次__________，每次循環(huán)一般可以分為_(kāi)變性、復(fù)性和延伸_三步。注：__變性___溫度上升到90℃左右，雙鏈DNA解聚為單鏈復(fù)性溫度下降到55℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合___延伸__溫度上升到72℃左右，Taq酶從引物起始合成互補(bǔ)鏈，可使新鏈由_____5′端向3′_____端延伸拓展：DNA復(fù)制的相關(guān)計(jì)算1.子代DNA分子總數(shù)：_____2n_____個(gè)；2.第n代產(chǎn)生的DNA數(shù)：______2n-1______個(gè)；3.子代DNA脫氧核苷酸鏈總數(shù)=______2n+1_____條4.第n代產(chǎn)生的DNA鏈數(shù)：______2n______條①n代后，DNA分子有______2n______個(gè)②n代后，DNA鏈有______2n+1______條③第__________代出現(xiàn)完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有______2n__________個(gè)⑤n代后，共消耗______2n+1-2______個(gè)引物⑥第n代復(fù)制，消耗了______2n______個(gè)引物⑦n代后，完整的目的基因有______2n-2n______個(gè)4.獲取目的基因的其他方法（1）構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因：將含有某種生物不同基因的許多_____DNA_____片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。①_____基因組文庫(kù)_____：包含一種生物所有的基因。②_____部分基因文庫(kù)_____：只包含一種生物一部分基因，如cDNA文庫(kù)。（2）利用化學(xué)方法人工合成：用DNA合成儀，要獲取的基因比較小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達(dá)載體的組成基因表達(dá)載體必須包括______目的基因______、______標(biāo)記基因_____、_____啟動(dòng)子__、______終止子______等（若需要能完成自主復(fù)制，還應(yīng)有______復(fù)制原點(diǎn)______）。（1）啟動(dòng)子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，緊挨__________轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)__________。③功能：__________RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA___________。④特殊類(lèi)型：_誘導(dǎo)型啟動(dòng)子___________。⑤誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的特點(diǎn)：__________當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)__________。（2）終止子①本質(zhì)：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的_DNA__________片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：__________使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)__________。注：?jiǎn)?dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比比較項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNA片段DNA片段mRNA上____三個(gè)相鄰的堿基_____mRNA上三個(gè)相鄰的堿基位置目的基因上游目的基因__下游___mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來(lái)翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）（3）標(biāo)記基因①作用：______便于重組DNA分子的篩選______②常見(jiàn)類(lèi)型：抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等（4）基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：一般用同一種限制酶分別切割載體和含有目的基因的DNA片段，再用DNA連接酶將兩者連接。（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—花粉管通道法（1）操作方式①用_______微量注射器________將______________含目的基因的DNA溶液_________直接注入__子房____中。②在_____植物受粉后_____的一定時(shí)間內(nèi)，_____剪去柱頭_____，將____DNA溶液____滴加在_____花粉管通道__________上，使目的基因借助_____花柱切面______進(jìn)入___胚囊___。（2）受體細(xì)胞：_____受精卵__________。2.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞—農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（1）轉(zhuǎn)化：__________目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程_________________________________。注：此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。（2）農(nóng)桿菌特點(diǎn)：①能在自然條件下侵染__________雙子葉植物_____和_____裸子植物__________，而對(duì)大多數(shù)__________單子葉植物_____沒(méi)有侵染能力。②農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有__________Ti質(zhì)粒_____，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將_____Ti質(zhì)粒_____上的_____T-DNA_____（________可轉(zhuǎn)移的DNA____）____轉(zhuǎn)移_____到被侵染的細(xì)胞，并且將其__________整合到該細(xì)胞的染色體DNA上__________。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過(guò)程：將目的基因插入_________Ti質(zhì)粒的T-DNA__________中，通過(guò)農(nóng)桿菌的_轉(zhuǎn)化_____作用，就可以使目的基因____進(jìn)入植物細(xì)胞_____，并___________整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上__________，使目的基因能夠_____維持穩(wěn)定和表達(dá)__________。3.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞—顯微注射法（1）受體細(xì)胞：______受精卵______注：受精卵容易表現(xiàn)出全能性。4.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞—Ca2+處理法（1）受體細(xì)胞：常用________原核生物____作為受體細(xì)胞，其中以______大腸桿菌______最廣泛（2）原核生物的優(yōu)點(diǎn)：_______________繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)____________________（3）Ca2+處理法（_____感受態(tài)細(xì)胞法_____）的一般過(guò)程：——Ca——Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性Ca2+處理大腸桿菌——這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞——這種細(xì)胞稱(chēng)為感受態(tài)細(xì)胞使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中——將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中——一般利用溫度變化導(dǎo)入總結(jié)：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法受體細(xì)胞類(lèi)型方法說(shuō)明特點(diǎn)植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞→將目的基因整合到植物細(xì)胞染色體的DNA上→目的基因表達(dá)經(jīng)濟(jì)、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞→目的基因表達(dá)簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法動(dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動(dòng)物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動(dòng)物將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的方法微生物細(xì)胞Ca2＋處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）用Ca2＋處理微生物細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→將基因表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→在一定溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、有效（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的檢測(cè)方法判斷標(biāo)準(zhǔn)目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物的DNA_____DNA分子雜交_____技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了_____mRNA_____分子雜交技術(shù)是否出現(xiàn)_____雜交帶_____目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)_____抗原—抗體雜交_____技術(shù)是否出現(xiàn)雜交帶個(gè)體水平的檢測(cè)如抗蟲(chóng)、抗病的接種實(shí)驗(yàn)是否表現(xiàn)出相應(yīng)的特性1.DNA分子雜交法（DNA探針?lè)ǎ〥NA分子雜交的基礎(chǔ)：具有\(zhòng)t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"互補(bǔ)堿基序列的\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"DNA分子，可以通過(guò)\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"堿基對(duì)之間形成\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"氫鍵等，形成穩(wěn)定的\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"雙鏈區(qū)。在進(jìn)行DNA分子雜交前，先要將兩種生物的DNA分子從細(xì)胞中提取出來(lái)，再通過(guò)加熱或提高pH的方法，將雙鏈DNA分子解旋成為單鏈，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性。然后，將兩種生物的DNA單鏈放在一起雜交，其中一種生物的DNA單鏈用\t"/item/DNA%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"同位素進(jìn)行標(biāo)記。如果兩種生物DNA分子之間存在互補(bǔ)的部分，就能形成雙鏈區(qū)。由于同位素被檢出的靈敏度高，即使兩種生物DNA分子之間形成百萬(wàn)分之一的雙鏈區(qū)，也能夠被檢出。2.分子雜交分子雜交其基本原理是待測(cè)單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（做探針）間通過(guò)\t"/item/%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"堿基配對(duì)形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類(lèi)型的\t"/item/%E5%88%86%E5%AD%90%E6%9D%82%E4%BA%A4/_blank"雜交分子。3.抗原-抗體雜交Western雜交，即蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交。與\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"SouthernBlot或\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"NorthernBlot雜交方法類(lèi)似，WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"PAGE（\t"/item/%E8%9B%8B%E7%99%BD%E8%B4%A8%E5%8D%B0%E8%BF%B9%E6%B3%95/_blank"聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，