生物技術大實驗課件

生物技術大實驗課件實驗內(nèi)容實驗一、目的基因的引物設計實驗二、總RNA的提取實驗三、cDNA合成實驗四、PCR擴增實驗五、PCR產(chǎn)物回收純化實驗內(nèi)容實驗六、連接反應實驗七、細菌轉(zhuǎn)化實驗八、藍白斑篩選實驗九、PCR檢測陽性克隆實驗十、測序及序列分析實驗安排第14周：指導學生熟悉cDNA克隆的整個過程5月23日理論講解；實驗室安全教育；溶液和培養(yǎng)基的配制；刀具滅菌；5月24日總RNA提取及電泳檢測5月25日cDNA合成和PCR擴增5月26日產(chǎn)物回收純化、連接反應、細菌轉(zhuǎn)化5月27日藍白斑篩選和陽性克隆檢測，送測序第15-16周：開放實驗室，每小組選擇目的基因，自行設計引物（需在第13周完成），然后完成所選目的基因的cDNA克隆。實驗要求1、分組實驗，每小組選1小組長，負責整個小組的實驗安排，各組員均需積極參與實驗。最后以小組為單位進行考核，即以各小組實際的實驗結果進行評分，不另外安排考試。2、實驗結果主要包括：總RNA電泳圖、內(nèi)參基因檢測cDNA的電泳圖、PCR電泳圖、膠回收電泳圖、平板的藍白斑圖、PCR檢測陽性克隆的電泳圖，每人交1份實驗報告，實驗報告需要對自己的實驗結果進行深入的分析和討論。3、整個大實驗期間，全體同學需嚴格遵守各個實驗的規(guī)章制度，確保水、電安全，同時在實驗期間要嚴格遵守操作規(guī)范，確保人身安全。

設計引物提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNAPCR擴增目的片段回收目的片段插入載體重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽性克隆測序序列分析基因克隆的基本過程實驗一、引物設計引物是PCR特異性反應的關鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度引物設計是否合理直接影響目的基因的克隆

引物設計的原則①引物長度：一般為15-30個堿基，常為20個堿基，太長會影響擴增效率，太短又會影響擴增的特異性。②引物退火溫度：上、下游引物的退火溫度不能相差太大在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,ATGC最好隨機分布④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構避免兩引物之間互補，特別是3`端⑤引物3’端的堿基要求嚴格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基⑥引物5’端可以加上合適的酶切位點方便酶切引物設計相關軟件的介紹ClustalX：用于尋找不同物種相同基因cDNA序列的同源區(qū)PrimerPremer5：用于尋找最佳的引物，會提供各種引物參數(shù)ClustalX以克隆黑鯛的NPY基因為例：在NationalCenterforBiotechnologyInformationNCBI基因庫中搜索相近物種的NPYcDNA序列用ClustalX軟件對所搜索到的cDNA進行序列比對找出高度同源區(qū)在該區(qū)設計特異或簡并引物PrimerPremer5把CLUSTALX比對好的aln文件導入primerpremer5,按照界面提示，依次點擊primer——search——OK——result——選擇期望擴增片段大小的引物每小組自行選擇一個感興趣的目的基因進行引物的設計，要求：該基因在NCBIgeneBank中尚未發(fā)表所選物種必需是我們能獲取的材料學會在NCBIgeneBank中搜索相關物種的目的基因序列學會ClustalX，PrimerPrimer5軟件的使用設計出合理的引物2對，供后面使用。實驗二提取總RNA原理：利用Trizol（異硫氰酸胍-苯酚）快速裂解細胞，使RNA從細胞核中釋放出來安全注意事項DEPC：焦碳酸二乙酯，是強的蛋白變性劑和致癌物。開瓶時要使瓶子盡可能遠離操作者，因為內(nèi)部的壓力可能導致飛濺。操作中應戴上手套，并在通風廚中進行；有機溶劑：RNA提取試劑為有機揮發(fā)試劑（硫氰酸胍-苯酚、氯仿、異丙醇），均有毒，需在通風廚操作或屏息操作，少講話，以免將有毒氣體吸入體內(nèi)。若試劑不小心沾到皮膚上，請立即用自來水沖洗；EB：溴化乙錠，是誘變劑，具有高致癌性，配制使用時，應戴乳膠手套，并且不要將該染色液灑在桌面或地面上，凡是接觸過EB的器皿或物品，必須經(jīng)特殊處理后，再進行清洗或棄去。提取RNA注意事項RNA酶是一種非常穩(wěn)定的酶，它由一條多肽鏈組成，變性后易復性，耐熱，煮沸能保持大部分的活性，RNA酶活性不依賴任何輔酶，pH值耐受范圍很寬。外源性RNA主要來源于空氣以及操作者的手、汗液等，內(nèi)源性RNA酶則主要來源于樣品的組織細胞。因此要得到均一性和完整性好的總RNA，就要有效地抑制外源性和內(nèi)源性RNA酶。如何去除RNA酶？（1）DEPC水：每1L雙蒸水中加入1mLDEPC，終濃度為0.1%，于室溫攪拌過夜，高壓滅菌。（2）金屬解剖器具和玻璃器皿經(jīng)180℃烘烤5小時，以滅活RNA酶。（3）塑料離心管、槍頭及槍頭盒等塑料用品均用DEPC水浸泡過夜后，高壓滅菌烘干后使用。（4）瓊脂糖凝膠電泳槽、制膠模具用3%的過氧化氫浸泡過夜后，用DEPC水洗凈備用。提取RNA的步驟Trizol

（異硫氰酸胍-苯酚）快速裂解細胞氯仿分層（三層：RNA，蛋白質(zhì)，DNA）異丙醇沉淀75%酒精洗滌測定總RNA的OD260/OD280值（1.8-2.0）0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量（28S：18S=2：1）下面以東盛公司通用RNA提取試劑盒為例說明具體的操作過程28S18S5S黑鯛垂體、肝臟組織總RNA檢測電泳圖28S和18SrRNA兩條明亮的帶，且28S的條帶的亮度約為18S的2倍，說明總RNA質(zhì)量很好，可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄實驗。實驗三.反轉(zhuǎn)錄（cDNA合成）原理真核生物mRNA3’未端存在polyA，用oligdT作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成與之互補的cDNA.試劑盒：TOYOBO公司的RevertAidTMHMinus

FirstStrandcDNASynthesisKit反轉(zhuǎn)錄步驟（1）在PCR管中加入：1-1.5μgRNA1μlDNaseIbuffer1μlDNaseIDEPC水upto10μl混合均勻。短暫離心后，37℃30分鐘。（2）向反應管中加入：1μlEDTA，65℃10分鐘反應后迅速置冰上。（3）向反應管中加入：1μl50μMoligodT（4）混勻后，70℃反應5分鐘。反應后立即將PCR管放置在冰上。反轉(zhuǎn)錄步驟（4）在每個反應管中加入以下試劑：5×reactionbuffer4μlRibolockTMRibonucleaceinhibitor1μl10mMdPmix2μl混勻后，37℃反應5分鐘（5）每個反應管中各加入RevertAidTMHMinisM-MulvRT（200U/μl）1μl，終體積達20μl。（6）42℃反應60分鐘后，70℃反應10分鐘終止反應，樣品直接進行PCR反應或貯存于–20℃?zhèn)溆?。cDNA質(zhì)量的檢測用看家基因（如β-actin，18SrRNA等）進行檢測設計研究物種的看家基因引物以新合成的cDNA為模板，用看家基因引物進行擴增，然后電泳檢測，看看能否擴出清晰、明亮的看家基因條帶，如果可以則初步說明反轉(zhuǎn)錄是成功的黑鯛14種組織cDNA的檢測電泳圖由上可以看出，14種組織的cDNA均可擴出其內(nèi)參基因β-actin清晰、明亮的條帶，說明反轉(zhuǎn)錄成功，cDNA可用于下一步的PCR擴增實驗聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，PCR

）是快速擴增DNA序列最常用的方法。

PCR反應的模板DNA若是基因組上的某個片段，就稱為genomicPCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。實驗四.PCR擴增

（聚合酶鏈式擴增反應）實驗四.PCR擴增

（聚合酶鏈式擴增反應）實驗原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。單鏈DNA在互補寡聚核苷酸片段的引導下，可以利用DNA聚合酶按5’→3’方向復制出互補DNA。雙鏈DNA分子經(jīng)高溫變性后成為兩條單鏈DNA，它們都可作為單鏈模板DNA，在相應的引物引導下，用DNA聚合酶復制出產(chǎn)物DNA。PCR技術的原理首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補鏈。PCR分三步：

DNA解鏈（變性）引物與模板DNA結合（退火）

DNA合成（鏈的延伸）經(jīng)不斷重復循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應是2n,實得1.8n.圖5-7聚合酶鏈式反應（PCR）技術圖5-8PCR指數(shù)擴增時循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。94℃加熱降低反應溫度（退火，約50℃），約0.5-1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上。50℃~60℃，退火引物與模板DNA相結合將反應混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補鏈。PCR擴增，72℃左右,按每分鐘1000個堿基對設計循環(huán)往復PCR反應五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）PCR的標準反應體系10×擴增緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5u

（Mg2+）1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ulHomePCR反應程序94℃預變性3分鐘；94℃變性30秒；60℃退火30秒；72℃延伸30秒；72℃延伸30分鐘；4℃保存PCR產(chǎn)物。35個循環(huán)PCR產(chǎn)物的電泳檢測根據(jù)上游引物和下游引物的位置，計算出預計產(chǎn)物的大小，如上游引物位于100bp處，下游引物位于600bp處，則產(chǎn)物大小應為500bp.將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖膠電泳，通過DNAmarker判斷產(chǎn)物大小，若與預計大小相符，則可初步確定產(chǎn)物為目的基因的擴增產(chǎn)物，可進行下一步的目的DNA純化實驗。不同引物的電泳結果，左邊第一條均為DNAmarker實驗五.PCR產(chǎn)物的分離、

回收和純化實驗原理基于降低凝膠的熔點以釋放DNA，然后通過酚/氯仿抽提后乙醇沉淀回收，也有公司生產(chǎn)的商品化的試劑盒可用，這些試劑盒多采用凝膠裂解液（如含有降低熔點的NaI）融化凝膠釋放DNA后，采用特殊的硅膠樹脂吸附DNA后，用洗液洗去雜質(zhì)，最后用洗脫液洗出DNA。實驗步驟1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V,30min)分離DNA片段在紫外光下切下目的片段膠回收純化測定回收后DNA的濃度。東盛生物公司DNA凝膠回收試劑盒具體操作如下：預計目的條帶，用刀片切下此條帶原理ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下，由ＤＮＡ連接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段，相鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸脂鍵的生物化學過程，ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中,但是在連接反應時,外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細調(diào)整連接反應中兩個DNA的濃度，以便使實驗六.目的片段插入載體“正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達到最佳水平，此外還常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團以抑制載體DNA的自身環(huán)化。3.利用T4DNA連接酶進行目的DNA和載體的體外連接反應，也就是在雙鏈DNA5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價鍵。如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個新的磷酸二酯鍵；如載體DNA已脫磷，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，此時產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個單鏈缺口，在導入感受態(tài)細胞后可被修復。連接試劑盒TArgetCloneTMTAK-101包括以下：

pTA2Vector（50ng/μl）

2×LigationBuffer

T4DNALigase具體實驗步驟（1）取出pTA2Vector，2×LigationBuffer，T4DNALigase。

注）將pTA2Vector和2×LigationBuffer于室溫溶解后，必須進行spindown，然后冰浴放置。特別由于pTA2Vector的dＴ突出末端不穩(wěn)定，請避免長時間放置于室溫。另外，也請避免反復凍溶（反復凍溶10次以內(nèi)，不會引起性能降低）。（2）按以下組成配制連接液?

組成 連接液

滅菌蒸餾水 （3-x）μｌ 2×LigationBuffer 5μｌ pTA2Vector（50ng/μl）1μｌ PCＲ產(chǎn)物（克隆的對象） xμｌ

T4DNALigase 1μｌ 合計10μｌ 注）加入的PCR產(chǎn)物量根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度、純度、大小,DNA序列等的不同而不同，通常pTA2Vector和PCR產(chǎn)物mole比可設定為１：３，一般都可以得到很好的結果。pTA2Vector的濃度為50ng/μl、大小約3.0kb，所以請使用通過以下公式求的Xμl以上的PCR產(chǎn)物。

X=５０Y÷

Z（Ykb：PCR產(chǎn)物的大小、Zng/μl：PCR產(chǎn)物濃度）例)將20ng/μl的PCR產(chǎn)物（0.5kb）按3：1的mole比配制反應液，根據(jù)公式50ｘ0.5÷20=1.25μｌ。如果PCR產(chǎn)物量過少，會導致克隆效率下降。請務必注意。（3）將反應液于室溫（15～25℃）進行30分鐘反應?注）連接較短DNA片斷（2kb以下），通過5分鐘反應就能得到充分的克隆效率。另外，如果延長反應時間，可提高克隆效率。如果進行過夜（12～18小時左右）反應時，請于4℃進行。實驗七.引入寄主細胞：細菌轉(zhuǎn)化原理大腸桿菌在0℃CaCL2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物種的DNA形成抗DNase的羥基一鈣磷酸復合物黏附與細胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進吸收DNA復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細胞復原并分裂增值。在被轉(zhuǎn)化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。實驗步驟1、感受態(tài)細胞的制備為提高效率，可對受體菌進行物理或化學處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過這種處理的細胞被稱作感受態(tài)細胞（competentcells）。感受態(tài)細胞的制備方法：CaCl2法電擊法CaCl2法制備感受態(tài)細胞挑DH5α單菌落接種于5mlLB培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)至OD550=0.4；2ml培養(yǎng)液接種于40ml預熱的LB培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)OD550=0.45-0.5；將菌液置冰上15分鐘，在4℃下，4,000×g離心5分鐘收菌；棄去上清，加入15mlTFB1，用槍頭輕輕吸打使細菌重懸，在冰上放置15分鐘，4℃，4,000×g離心5分鐘收菌；3mlTFB2重懸細菌，冰上放置15分鐘；按100-200μl的量分裝到預冷的1.5ml的離心管，在冰上放置4-6小時直接用于轉(zhuǎn)化或置于-80℃保存。2、轉(zhuǎn)化（1）將5μl連接產(chǎn)物加入已制備好的感受態(tài)菌液中，在冰上放置40分鐘。（2）42℃水浴1.5分鐘。（3）冰上放置10分鐘后加入500μlLB，150rpm振蕩培養(yǎng)40分鐘。（4）10,000×g離心1分鐘后吸掉菌液400μl，用槍頭吸打重懸余下的菌液，加入40μlX-gal和8μlIPTG，然后均勻涂布于Amp+LB固體培養(yǎng)平板上。37℃培養(yǎng)1小時后，倒置培養(yǎng)16小時。

實驗八.篩選陽性克隆

藍白斑篩選

原理LacZ編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸的α-肽，IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導該基因表達，合成的β-半乳糖苷酶α-肽能與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶相互補，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成藍色的溴氯吲哚，使生長于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍色。反之，白色則是有插入外源基因，并破壞了LacZ基因。圖5-5細菌轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選

實驗前需備的培養(yǎng)基和試劑1、LB培養(yǎng)基將10gbacto-tryptone,5gbacto-yｅastextract,10gNaCｌ于1L蒸餾水中融解，用NaOH調(diào)至pH7.2?2、100mM

IPTG將0.24gIPTG融解于蒸餾水，終量為10ml?過濾滅菌后于-20℃保存?3、4%X-gal將0.4gX-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside）于N,N-dimethyl-formamide內(nèi)溶解，終量10ml?于-20℃遮光保存?4、LB/AP/IPTG/X-gal板

向LB/AP板上涂布100mMIPTG,4%X-gal各20μl，干燥后待用?具體實驗步驟用無菌牙簽挑取平板上白色單菌落(5–10個)分別接種至3–5mlLB培養(yǎng)液(Amp+)中，200rpm培養(yǎng)14–16小時。平板保存于4℃。室溫下，10,000×g離心1分鐘收菌。（存-20℃）離心前每管菌液取1μl為模板進行PCR擴增電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為目的條帶陽性克隆PCR電泳檢測圖由上可看出，除倒數(shù)第2個外均可擴出清晰明亮的目的條帶，說明目的基因已成功轉(zhuǎn)染大腸桿菌，此菌體可送去測序。實驗九.陽性克隆測序DNA測序的原理：雙脫氧終止法了.在測序用的緩沖液中含有四種dNTP及聚合酶.測序時分成四個反應,每個反應除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸(稱為ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP),然后進行聚合反應.在第一個反應物中,ddATP會隨機地代替dATP參加反應一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈,由于其3位的羥基變成了氫,所以不能繼續(xù)延伸.所以第一個反應中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了;同理第二個反應產(chǎn)生的都是以C結尾的;第三個反應的都以G結尾,第四個反應的都以T結尾,電泳后就可以讀出序列了.測序的目的是得到某一段DNA的核苷酸排列順序。DNA測序結果的判讀DNA結