第三章 植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)課件

第三章

植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)

第一節(jié)組織培養(yǎng)所需要的基本條件第二節(jié)組織培養(yǎng)中的無菌技術(shù)第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制第四節(jié)組織培養(yǎng)的基本程序第五節(jié)外植體的褐變與玻璃化苗

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第一節(jié)組織培養(yǎng)所需要的基本條件所需條件實驗室設(shè)置儀器設(shè)備無菌條件第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)一、實驗室的設(shè)計與要求

實驗室的設(shè)計和裝備程度應(yīng)依據(jù)工作目的、規(guī)模以及實際的經(jīng)濟(jì)狀況而定。 （一）化學(xué)實驗室

（二）無菌操作室

（三）培養(yǎng)室

（四）觀察鑒定室

（五）馴化移植室

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（一）化學(xué)實驗室用途:化學(xué)實驗室是進(jìn)行預(yù)處理和前期準(zhǔn)備的場所

器皿、用具的洗滌、干燥、滅菌和保存培養(yǎng)基配制植物材料的清洗和預(yù)處理存放各種器皿、設(shè)備和藥品等需要的裝備:化學(xué)實驗室應(yīng)有實驗臺、藥品柜、防塵櫥或防塵柜冰箱、烘箱、天平、酸度計、水浴鍋、電爐、滅菌鍋、蒸餾水器等設(shè)備也可存放于該室的不同位置，相應(yīng)的操作也在該室中進(jìn)行。要求干凈明亮，氣流暢通。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（二）無菌操作室用途：無菌操作室也稱無菌室或接種室，它是組織培養(yǎng)中進(jìn)行無菌操作的場所。設(shè)備：超凈工作臺

、滅菌器等。要求：一般要求室內(nèi)干爽、整潔、明亮，墻壁光滑平整不易積染灰塵，地面平坦無縫便于清洗和消毒。室內(nèi)應(yīng)盡量少放設(shè)備和器械，除在出入口安裝移動滑門外，其他門窗均應(yīng)密閉，以保證沒有通風(fēng)和空氣對流，通風(fēng)換氣必須通過空氣調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。定期用甲醛和高錳酸鉀或其他藥劑進(jìn)行消毒滅菌，室內(nèi)的上方和門口也應(yīng)安裝紫外燈，使室內(nèi)保持良好的無菌或少菌狀態(tài)。

無菌室外應(yīng)設(shè)緩沖室

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)接種室第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)超凈工作臺第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)紫外燈第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)緩沖室第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)消毒藥第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)消毒器第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)滑門第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（三）培養(yǎng)室用途：培養(yǎng)室是培養(yǎng)接種材料的場所。設(shè)備：搖床、光照培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、空調(diào)、加濕除濕設(shè)備、時間程控器械。要求：優(yōu)越的照明條件：日光燈良好的溫控條件：自動控溫電爐或空調(diào)等

能夠保持一定的濕度：除濕機(jī)、加濕機(jī)（器）

能進(jìn)行通風(fēng)換氣。通風(fēng)窗口或加裝排風(fēng)扇

環(huán)境條件的控制與要求第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（四）觀察鑒定室用途:對培養(yǎng)物進(jìn)行觀察鑒定的場所。設(shè)備:顯微觀察設(shè)備:雙筒實體顯微鏡、高倍顯微鏡、倒置顯微鏡及其相應(yīng)的顯微照相設(shè)備、離心機(jī)、測微尺和血球計數(shù)器等。組織切片染色設(shè)備:普通和超薄切片機(jī)、磨刀機(jī)、烤片臺或烘片器、恒溫箱、染色缸等。照相沖洗設(shè)備等:照相機(jī)、近視鏡、測光表、顯影罐、放大機(jī)、暗袋或暗箱等。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)離心機(jī)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（五）馴化移植室用途：主要用于試管苗的馴化和移栽；也可用于母株的預(yù)栽培。設(shè)施：室內(nèi)應(yīng)備有彌霧裝置、蔭棚、移植床（苗床）、恒溫恒濕控制儀、光照調(diào)節(jié)裝置等設(shè)施以及培養(yǎng)土、培養(yǎng)盆（缽）、育苗盤等器材。馴化移植室1、2第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)二、常用儀器設(shè)備與器械（一）常用儀器設(shè)備：超凈工作臺；高壓蒸汽滅菌鍋；冰箱；烘箱；天平；蒸餾水器；酸度計；搖床與轉(zhuǎn)床；光照培養(yǎng)箱

（二）常用器皿與器械

1．培養(yǎng)器皿

(圖2)

2．盛裝器皿

3．計量器皿

4．滅菌器械

5．接種器械

6．其他：漏斗、玻璃棒、落水架、器械支架、洗瓶、毛刷等。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)三、環(huán)境條件的控制與要求光照溫度

對大多數(shù)植物而言，25℃±2℃的培養(yǎng)溫度是適宜的，低于15℃和高于35℃的溫度對培養(yǎng)都不利。喜溫性植物：在26~28℃（如茄科、葫蘆科、蘭科、蕓香科、禾本科、薔薇科等）；冷涼性植物：18~22℃或<25℃較為適宜（如百合科、十字花科、鳶尾科、菊科等）。濕度：一般控制在60%~80%之間。通氣狀況：第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（一）光照1．光周期:一般采用周期性關(guān)照的方法。但對不同植物、不同培養(yǎng)物的特性、不同培養(yǎng)階段所采取的措施不同。通常在愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用三種方法：全暗、周期性光照、散射性光照。多數(shù)植物適宜全暗或弱光下培養(yǎng)；而在器官分化階段，則需要一定時間的光照。一般每天10~16h的光照即可滿足大多數(shù)培養(yǎng)的需要；2.光照強度：一般光強在1000~3000lx；一般在培養(yǎng)的后期如生根階段增強光照強度。3.光質(zhì)：離體培養(yǎng)條件下，一般采用日光燈進(jìn)行光照，光譜成分主要是藍(lán)紫光，光譜的波長為419~467nm。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第二節(jié)組織培養(yǎng)中的無菌技術(shù)一、控制污染的重要性二、污染類型

真菌污染與細(xì)菌污染（區(qū)別表）三、造成培養(yǎng)物污染的途徑及防除措施

①培養(yǎng)器皿； ⑤培養(yǎng)室環(huán)境； ②培養(yǎng)基本身； ⑥操作器械； ③植物材料； ⑦操作人員。 ④接種室環(huán)境；第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)污染類型特征來源途徑發(fā)生時間細(xì)菌污染黏液狀或發(fā)酵泡狀菌斑；出現(xiàn)渾濁或云霧狀痕跡材料帶菌操作人員不慎培養(yǎng)基滅菌不徹底接種后1-2天真菌污染形成不同顏色和形狀的霉層材料帶菌接種環(huán)境超凈工作臺失效接種后5-10天表4細(xì)菌污染與真菌污染的主要區(qū)別第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)真菌污染2第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（一）培養(yǎng)器皿的清洗和滅菌

2．培養(yǎng)器皿的滅菌

（1）高壓蒸汽滅菌法。（2）干熱滅菌法。烘箱中150℃

（40分鐘）或120℃

（2小時）。1．培養(yǎng)器皿的清洗

:簡單清洗去除污物

泡于洗滌液

自來水刷洗清水反復(fù)沖洗蒸餾水漂洗烘干或涼干使用或暫存第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（二）培養(yǎng)基的滅菌1.高壓蒸汽滅菌法A.裝鍋不可過滿，要使鍋內(nèi)留有一定空間，便于熱蒸汽的暢通。B.正式滅菌前將鍋內(nèi)冷空氣排盡。C.要根據(jù)滅菌對象的性質(zhì)嚴(yán)格把握滅菌時間和滅菌溫度。

2.過濾滅菌法A.適用于液體培養(yǎng)基B.培養(yǎng)基中易在高溫高壓下分解減效或失效的物質(zhì)。(濾膜孔徑為0.22~0.45μm)。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)基分裝量與高壓蒸汽滅菌所必須的最少時間*20~501575~15020250~50025100030150035培養(yǎng)基分裝量（mL）在121℃下滅菌所必需的最少時間(min)200040第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)120℃

121℃

122℃

排汽一定舒緩，以免造成培養(yǎng)基沸騰，沾染瓶塞引起污染。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)負(fù)壓過濾器第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（三）植物材料消毒

1．減少材料帶菌的防范措施（1）取材前對母株的預(yù)處理

：減少帶菌機(jī)會，改善生理狀態(tài)。（2）對采來的離體材料進(jìn)行清洗、刮除、沖洗等預(yù)處理。（3）確定最佳的取材時期。（4）內(nèi)部已污染的材料棄之不用。2.材料表面滅菌（1）對滅菌劑的要求（2）常用滅菌劑種類（3）滅菌方法第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)常用表面滅菌劑的使用及其效果

種類使用濃度（%）滅菌時間（分）滅菌效果酒精升汞漂白粉次氯酸鈉次氯酸鈣70-750.1-0.2飽和上清液2-109-100.1-55-128-155-305-30（+）好（+++）極好（++）很好（++）很好（++）很好第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)滅菌效果好：徹底、安全、高效。對植物材料傷害?。粶缇鷦┮紫蛞追纸鈱缇鷦┑囊蟮谌?+植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)表面滅菌方法滅菌劑的使用依據(jù)材料特性（植物種類、取材部位、大小、老嫩等）確定滅菌劑的種類、處理時間和處理濃度。做到既達(dá)到良好的滅菌效果又不損傷材料。一般多種藥劑配合使用，交替浸泡、綜合殺菌。對于表面具有蠟質(zhì)層、絨毛的材料，滅菌時可加入少量浸潤劑（如吐溫-20）或輔以磁力攪拌、超聲振動等措施，以提高滅菌效果。滅菌劑要充分浸沒材料。滅菌處理后，材料必須在無菌水中漂洗3-5次，以除去表面殘留的滅菌劑。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)經(jīng)常打掃，保持清潔；接種室消毒：

室內(nèi)空氣消毒：

熏蒸滅菌法

紫外燈照射滅菌 噴霧降塵

室內(nèi)地面、墻壁、桌面等：用消毒液（2%的新潔爾 或70%的酒精）擦拭滅菌。

接種臺消毒:

紫外燈照射

70%-75%的酒精噴霧或擦拭臺面。使用超凈工作臺:（四）接種室環(huán)境滅菌第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)超凈工作臺粗過濾器高效過濾器操作臺面使用超凈工作臺應(yīng)注意的問題第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)

超凈工作臺不應(yīng)安裝在塵埃太多的地方。

在使用前應(yīng)預(yù)熱30-40分鐘。

操作前應(yīng)先將實驗材料和操作器械、藥品等物品事先放入臺內(nèi)，不要中途拿進(jìn)。

臺面上放置的東西不宜太多，特別是注意不要把東西迎面堆的太高，以免擋住氣流。

定期檢查，更換過濾器。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)滅菌方法灼燒滅菌法：使用前插入70%或95%的酒精中浸一下，然后放 酒精燈火焰上灼燒。

應(yīng)注意的問題灼燒應(yīng)均勻充分；灼燒一次不宜使用過久，應(yīng)多次反復(fù)灼燒；灼燒后冷卻再用。采用滅菌器滅菌（六）接種器械的滅菌第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（五）培養(yǎng)室環(huán)境滅菌（1）定期打掃，保持整潔；（2）地面、墻壁、培養(yǎng)架以及其他器材表面：用消毒劑進(jìn)行擦洗或噴霧：酒精、來蘇兒水、新潔爾滅。

（3）空氣滅菌：

紫外燈照射；

定期熏蒸滅菌（改用乙二醇） 噴霧滅菌。（3）濕度不宜過大（60%-80%）。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（1）進(jìn)入接種室前應(yīng)洗凈雙手，穿好工作服，戴好工作帽和口罩。（2）接種操作前用75%的酒精擦拭雙手。（3）接種操作時要端座，不要俯身工作臺，口鼻遠(yuǎn)離接種區(qū)（如瓶口），盡量不要講話。（4）打開培養(yǎng)瓶口（拔棉塞時和蓋棉塞時）前和蓋蓋之前，堅持灼燒培養(yǎng)瓶口和蓋口（或棉塞），將微生物固定，防止進(jìn)入瓶內(nèi)。（5）接種過程中手臂切忌從培養(yǎng)基、無菌材料、接種器械等物品上方經(jīng)過，以免引起污染。（6）當(dāng)培養(yǎng)容器敞著口時，應(yīng)傾斜瓶口防止污染物進(jìn)入培養(yǎng)容器。（七）操作人員的無菌操作第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制基本培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)基的作用一、培養(yǎng)基的組成及其作用

（一）無機(jī)元素

（二）有機(jī)營養(yǎng)

（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)

（四）附加物類

（五）培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓

二、培養(yǎng)基種類及其特點

三、培養(yǎng)基的配制

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)基本培養(yǎng)基與完全培養(yǎng)基維生素、氨基酸糖、淀粉椰乳、蘋果汁、香蕉泥植物激素C、H、O、NS、P、B、I抗生素K+、Ca2+、

Mn2+

Mg2+、

Zn2+炭粉基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)根據(jù)植物所需濃度分為大量元素（>0.5mmol/L）和微量元素（1）大量元素種類：C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg等。作用：N元素：組培中利用的無機(jī)氮主要有硝態(tài)氮(NO3-)和銨態(tài)氮(NH4+)兩種形式.應(yīng)注意：

A.培養(yǎng)基中一般硝酸鹽和銨鹽按一定比例配合使用，兩者比例大小應(yīng)根據(jù)植物種類做適宜調(diào)整。

B.培養(yǎng)基中硝酸鹽和銨鹽各自的含量過高或過低或比例不當(dāng)，均不利于培養(yǎng)物的培養(yǎng)(一般硝酸鹽≥25mmol/L,銨鹽＜8mmol/L)。（一）無機(jī)元素第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)種類：主要包括Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Na、Co、B、I等。作用：微量元素在植物生命活動過程中，多以酶系中的輔基形式起著重要作用。使用中應(yīng)注意的問題

若使用量過大，常會引起植物細(xì)胞酶系失活、代謝障礙、蛋白質(zhì)變性以及組織死亡等毒害現(xiàn)象。來源問題

不同培養(yǎng)基配方中的用量差別很大

植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基中離子濃度的比較（2）微量元素第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)

植物組織培養(yǎng)常用培養(yǎng)基中離子濃度的比較

NO3mmol/L3.3339.4133.7925.0018.4027.99NH4

20.6215.002.009.007.01總N

3.3360.0348.7927.0327.4035.00P

0.141.252.501.080.502.94K

1.6620.0521.2925.009.9030.93Ca

1.272.992.991.021.491.13Mg

3.041.501.501.000.750.75Cl

0.875.985.982.042.992.26Feμmol/L12.50100.00100.0050.10100.00100.00S

4502.001730.001610.002079.90996.804379.13Na

2958.00202.00237.201089.00202.00202.00B

24.20100.0010.0048.50161.8025.88Mn

22.40100.0010.0059.20112.0019.73Zn

10.4030.0037.307.0034.705.22Cu

0.040.100.010.100.10

Mo

0.0071.000.101.001.00

Co

0.100.010.10

離子單位WhiteMSERB5NitschN6I

4.505.00

4.50

4.82第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（二）有機(jī)營養(yǎng)1.碳水化合物2.氨基酸3.維生素4.有機(jī)添加物幾種培養(yǎng)基有機(jī)成分的比較第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)肌醇100

100

100煙酸0.50.50.0550.51吡哆醇0.50.50.010.50.51硫胺素0.40.50.010.5110甘氨酸22322

葉酸

0.5

生物素

0.05

培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基（單位：mg/L）*MSERWhiteNitschN6B5蔗糖3%4%2%2%5%2%第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)1.碳水化合物作用：糖的加入主要是作為碳素來源和能量物質(zhì)，同時糖具有維持和調(diào)節(jié)培養(yǎng)基滲透壓的作用。種類：蔗糖、葡萄糖、果糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇等。應(yīng)用：

培養(yǎng)基中碳水化合物種類和濃度的選擇主要依據(jù)培養(yǎng)材料而定，也視培養(yǎng)階段而異。

應(yīng)用最廣泛的糖類是蔗糖。通常使用濃度在2%-5%，在有些情況下使用較高的濃度，如花藥培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)中。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)2.氨基酸類作用：為重要的有機(jī)氮源，對細(xì)胞的脫分化、再分化以及器官建成起重要作用，特別是胚胎發(fā)生中，多種氨基酸混合使用常起到良好的促進(jìn)作用。種類:甘氨酸、絲氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）等也是常用的氨基酸類。應(yīng)用甘氨酸、CH、LH最常用，前者的使用量較小一般再2~3mg/L，后兩者一般為100~1000mg/L。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)3.維生素類種類作用使用量(1mg/L)鹽酸硫胺素（VB1）

促進(jìn)細(xì)胞分裂,愈傷組織的形成0.4~1鹽酸吡哆醇（VB6）

促進(jìn)根的形成與生長0.5~1煙酸（Vpp）促進(jìn)植物代謝和胚胎發(fā)育

0.5~1肌醇（Myo-inositol）

促進(jìn)細(xì)胞壁的形成和愈傷組織增殖；促進(jìn)培養(yǎng)物生長、胚狀體和芽的形成；肌醇還有助于其他活性物質(zhì)發(fā)揮作用50~100抗壞血酸（Vc）

防止組織褐變

50-200第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)4．天然有機(jī)添加物類

種類：多種多樣，如椰乳、馬鈴薯汁、麥芽浸出物、酵母提取物等。應(yīng)用有時必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可行，但不能應(yīng)用于定量化研究。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對于調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生致關(guān)重要，是組培中的關(guān)鍵物質(zhì)。種類：

生長素類

細(xì)胞分裂素類

赤霉素類

乙烯

脫落酸第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)作用：主要作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂

,常被用于

:

誘導(dǎo)愈傷組織;

根的分化;

與一定量的細(xì)胞分裂素配合使用，可用于誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長；

胚狀體的產(chǎn)生；種類：2，4二氯苯氧乙酸（2，4-D） 吲哚乙酸（IAA）萘乙酸（NAA） 吲哚丁酸（IBA）萘氧乙酸（NOA）作用強弱：

2，4-D>NOA>NAA>IBA>IAA1.生長素類第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)應(yīng)用情況：使用濃度范圍為0.1~15mg/L，最常用的濃度為0.1~5mg/L。

2,4-D：誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的效果最強；趨向于抑制培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生；誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。

NAA：應(yīng)用最廣泛，常與細(xì)胞分裂素配合使用，用于愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化。

IBA：常用于生根。

IAA：穩(wěn)定性：

2,4-D、NAA性質(zhì)穩(wěn)定；IBA、IAA易變性。溶解：95%酒精或0.1mol/LNaoH第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（1）作用：主要用于促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的分化。 主要用于：

誘導(dǎo)芽的分化；

解除頂端優(yōu)勢，促進(jìn)側(cè)芽生長與莖芽的增殖；

延緩組織衰老，增強蛋白質(zhì)的合成，顯著改變 其他激素作用。（2）使用種類： 玉米素（ZT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA） 激動素（KT）、2-異戊烯基腺嘌呤（2iP）（3）活性強弱

ZT=2-iP>6-BA>KT。

2.細(xì)胞分裂素類第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（4）應(yīng)用情況：使用濃度范圍為0.1~10mg/L，常用的濃度為0.1~2mg/L。

ZT：作用最強；價格昂貴。

6-BA：應(yīng)用最廣泛。

2iP：在某些木本植物（杜鵑）的莖芽分化中效果不錯

KT：可部分代替6-BA的作用。（5）穩(wěn)定性：

6-BA和2-iP性質(zhì)穩(wěn)定；ZT、KT易變性。（6）溶解性：0.5或1mol/LNaoH或HCL第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)3.其他激素（1）赤霉素類常用的是GA3。GA3具有促進(jìn)莖細(xì)胞伸長和打破休眠的作用，主要用于促進(jìn)已分化莖芽的伸長生長、刺激胚狀體正常發(fā)育成小植株以及打破有些植物的種子、塊莖、磷莖等的休眠。（2）脫落酸

ABA具有抑制蛋白質(zhì)合成、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落的作用；也具有抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素和赤霉素發(fā)揮作用的效應(yīng)。（3）乙烯乙烯含量的提高，將會引起培養(yǎng)物衰老、玻璃化、落葉甚至死亡等不良反應(yīng)。

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)附加物類主要包括瓊脂、活性炭、抗生素、抗氧化劑、生長抑制劑等。

1.瓊脂 A.作用：

B.用量：0.4%--1%，用量過大培養(yǎng)基變硬，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散和培養(yǎng)物對養(yǎng)分的吸收；用量不足培養(yǎng)基凝固不良，起不到支撐作用。

2.活性炭A.作用：吸附功能，除去培養(yǎng)基中的有毒物或培養(yǎng)物產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物；防止組織褐變、刺激胚胎發(fā)生、利于培養(yǎng)物生根等功能。

B.用量：0.2%-0.5%（四）附加物類第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)3．抗生素

作用：防止和控制菌類污染，減少培養(yǎng)材料的損失。

種類：常用的抗生素有青霉素、鏈霉素、土霉素、慶大霉素等，用量一般在5~20mg/L。

使用抗生素不能代替無菌操作。

4．抗氧化劑

作用:控制或緩解培養(yǎng)材料的褐變

種類:半胱氨酸、抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等。5．生長抑制劑

作用:調(diào)節(jié)內(nèi)源與外源植物激素的平衡，利于培養(yǎng)物的生長和分化

種類:根皮苷、三碘苯甲酸、矮壯素、比久（B9）、間苯三酚等第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（五）培養(yǎng)基的酸堿度和滲透壓1.培養(yǎng)基的PH（1）調(diào)節(jié)PH的必要性（2）調(diào)節(jié)方法：酸度計或精密pH試紙，配好的培養(yǎng)基常偏酸，偏堿的情況很少見。（3）調(diào)節(jié)依據(jù)

培養(yǎng)基的pH因培養(yǎng)材料不同而異，大多數(shù)植物適宜的pH在5.6~6.0之間。

pH的大小影響到培養(yǎng)基的固化程度。Ph>6.0時，培養(yǎng)基將會變硬；<5.0時，培養(yǎng)基不能很好的凝固。

依據(jù)培養(yǎng)基中某些物質(zhì)的穩(wěn)定性。

Fecl2 PH>6.2失效 檸檬酸鐵 PH>6.0失效第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)2．培養(yǎng)基的滲透壓

（1）意義：當(dāng)培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基之間處于等滲時，或培養(yǎng)材料的滲透壓微低于培養(yǎng)基滲透壓時，培養(yǎng)材料才可能從培養(yǎng)基中汲取養(yǎng)分。（2）培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)

調(diào)節(jié)滲透壓往往從調(diào)節(jié)糖濃度著手。

滲透壓的調(diào)節(jié)應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)材料、培養(yǎng)目的等的不同進(jìn)行：對大多數(shù)植物而言，糖的使用濃度在2%~5%的范圍內(nèi)是適宜的。如：幼胚、原生質(zhì)體花粉培養(yǎng)：較高的滲透壓 根的分化： 較低的滲透壓

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)二、培養(yǎng)基種類及其特點

（一）培養(yǎng)基種類

種類特點舉例高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽的含量較高，微量元素種類齊全，營養(yǎng)組成和比例也比較合理，

MS、LS、BL、RM、ER等

較高硝酸鉀含量培養(yǎng)基

KNO3的使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他無機(jī)鹽

B5、N6、SH、GS等

中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高

Nitsch、NT、H、Miller等

低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低并且種類減少

改良White、Heller、WS、Knop、HB等

第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)NH4NO31650

720

KNO31900809502830CaCl2.2H2O440

166CaCl2

166

MgSO4.7H2O370750185185KH2PO4170

68400(NH4)2SO4

463Ca(NO3)2.4H2O

300

Na2SO4

200

NaH2PO4.2H2O

19

KCl

65

KI0.830.75

0.8H3BO36.21.5101.6MnSO4.4H2O22.35254.4ZnSO4.7H2O8.63101.5NaMoO4.2H2O0.25

25

MoO3

0.001

CuSO4.5H2O0.0250.010.025

CoCl26H2O0.025

Fe2(SO4)3

2.5

FeSO4.7H2O27.8

27.827.8Na2.EDTA.2H2O37.3

37.337.3組成MSWhiteNitschN6第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)三、培養(yǎng)基的配制配制母液量取母液并混合稱量瓊脂、蔗糖，充分熔解瓊脂。定容調(diào)PH分裝密封與標(biāo)記滅菌使用或暫存第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第四節(jié)組織培養(yǎng)的基本程序選擇品種、植株、取材部位截取、切割外植體外植體的滅菌與接種

組培苗的馴化與移栽

離體培養(yǎng)、根芽形成、植株再生第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)1.依據(jù)培養(yǎng)目的，選擇性狀優(yōu)良、生長健壯、無病蟲害的品種或植株。2.做好取材部位、取材季節(jié)、試材生理狀態(tài)和發(fā)育年齡的選擇。（1）取材部位A.培養(yǎng)目的；B.外植體（培養(yǎng)材料）應(yīng)易獲得，來源廣，易培養(yǎng)。C.外植體經(jīng)培養(yǎng)后是否會發(fā)生變異（變異的程度和優(yōu)劣）對大多數(shù)植物而言：

莖尖是較好的取材部位；

葉片是許多植物組培的起始材料；

對一些培養(yǎng)較困難的植物，可通過其子葉或下胚軸來建立起組織培養(yǎng)再生體系。一、培養(yǎng)材料的選擇和預(yù)處理第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)（2）取材季節(jié)（3）外植體大小的選擇

外植體的大小應(yīng)根據(jù)植物材料和培養(yǎng)目的而定：

枝段、莖段：包含腋芽，一般0.5-2cm

莖尖脫毒：0.2mm以下

葉片、鱗片等：0.5-2cm23.材料的處理

（1）母株的預(yù)栽培：溫室栽培、水培、暗培養(yǎng)等。（2）打破休眠：低溫和赤霉素處理。（3）對材料的簡單清理：去枯、去斑、清洗等。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)試材的生理狀態(tài)和發(fā)育年齡的影響一般沿植物主軸，越向上部分所形成的器官的生長時間越短其生理年齡也相應(yīng)越老，越接近發(fā)育上的成熟，越易形成花器官。沿植物主軸越向下，所形成的器官的生長時間越長其生理年齡也相應(yīng)越幼，越易形成芽器官。如煙草的表皮組培中，下部組織產(chǎn)生營養(yǎng)芽的比例高，而上部產(chǎn)生花器官的比例大。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)二、外植體的滅菌與接種

1.外植體的滅菌2.接種：經(jīng)過滅菌的植物材料，按照不同的培養(yǎng)要求，經(jīng)過剪切、分割處理后，移至培養(yǎng)基上（中）的全部操作過程，稱為“接種”。注意：

接種于固體培養(yǎng)基上的材料要求既要和培養(yǎng)基達(dá)到最大面積的接觸，又要避免完全嵌入培養(yǎng)基。

接種過程中應(yīng)避免任何外界和操作不當(dāng)引起的污染。

單瓶內(nèi)接多個材料時，應(yīng)使之均勻分散開

。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)1.調(diào)整好培養(yǎng)室的溫度、關(guān)照、濕度等培養(yǎng)條件。2.定期進(jìn)行觀察，根據(jù)變化做適宜調(diào)整。3.剔除遭污染的材料。三、外植體的培養(yǎng)外植體愈傷組織芽或胚狀體生根或壯苗芽或胚狀體完整試管苗第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)四、組培苗的馴化與移栽（一）組培苗的特點

1．根發(fā)育不良，無吸收功能或極低。

2．莖葉表面缺乏保護(hù)組織，氣孔難以關(guān)閉并且開口過大，極易散失水分。

3．葉綠體發(fā)育不良，葉綠素含量低，葉片的光合作用很弱。（二）組培苗的馴化與移栽

1.原則

2.過程第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)馴化過程應(yīng)遵循逐步過渡的原則。一般來說，在開始數(shù)天內(nèi)，馴化條件應(yīng)與離體培養(yǎng)時的環(huán)境條件相近，而在馴化后期，應(yīng)逐步過渡到與自然栽培條件相仿。以實現(xiàn)：異養(yǎng)無菌自養(yǎng)高濕低濕恒溫變溫有菌弱光強光過渡離體培養(yǎng)條件自然生長條件第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)組培苗的馴化移栽過程1.獲得根系良好的壯苗（生根或壯苗階段）。2.開瓶進(jìn)行濕度和光照鍛煉；

讓小苗直接接觸外界環(huán)境，加強光照強度，降低濕度，使小苗由異養(yǎng)逐步過度到自養(yǎng)。一般鍛煉一周左右。3.將經(jīng)初步鍛煉的小苗轉(zhuǎn)移到苗床上。

（1）移栽前應(yīng)將小苗基部的培養(yǎng)基洗凈，以免招致微生物侵染。（2）移栽后一定加強管理，注意保濕和遮蔭。（3）培養(yǎng)初期可以適當(dāng)澆灌營養(yǎng)液。4.將成活的小苗移栽到大田。第三章++植物組織培養(yǎng)常規(guī)技術(shù)第五節(jié)外植體的褐變與玻璃化苗一、外植體的褐變（一）褐變的原因

（二）影響褐變的因素

（三）控制褐變的措施

二、玻璃化苗

（