DNA片段的分離和回收-質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化-Li

實驗五瓊脂糖凝膠中DNA片段的別離和回收玻璃奶法別離回收瓊脂糖凝膠中DNA片段質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化第一局部瓊脂糖凝膠中DNA片段的別離和回收

——玻璃奶法別離回收瓊脂糖凝膠中DNA片段實驗?zāi)康模赫莆绽貌Ａ谭◤沫傊悄z中別離回收DNA片段的原理和操作技術(shù);了解其他幾種方法的原理與操作技術(shù)。DNA片段別離回收常用方法：電洗脫法低熔點瓊脂糖凝膠法DEAE濾膜插片法玻璃奶法電洗脫法將含DNA片斷的凝膠放在一個用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進入液相?；厥找合嗪蠹兓恋砥渲械腄NA分子。低熔點瓊脂糖凝膠法將切好的回收膠塊放在回收膠槽內(nèi)，在切去膠塊處參加低熔點瓊脂糖膠，待其凝固后將其小心放回電泳槽繼續(xù)進行電泳。待目的帶完全進入低熔點瓊脂糖膠后，在長波紫外燈下切下含有所需DNA帶的凝膠條，置于新的EP管中，加300μLTE。65℃水浴10min或更長使膠塊完全融化。酚氯仿抽提DNA，乙醇沉淀。DEAE濾膜插片法將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會兒，條帶上的DNA被膜片截留。取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個方法不適合做較大的DNA，因為洗脫比較困難。

玻璃奶法

實驗原理：玻璃奶(Glassmilk)：無毒、無味、無腐蝕作用的白色硅顆粒，能專一性結(jié)合0.2kb至50kb大小的DNA〔雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀或超螺旋〕，不結(jié)合RNA、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、有機溶劑、去污劑及其他可能抑制酶活性的有機或無機物。DNA與玻璃奶結(jié)合原理：在高鹽狀態(tài)下，玻璃奶周圍的負電荷被打破，并允許DNA的磷酸負電荷與玻璃奶特異性結(jié)合。在低鹽〔H2O/1×TE〕時溶解別離。DNA結(jié)合率影響因素：鹽濃度：DNA<100bp:高鹽狀態(tài)下結(jié)合率高。DNA>100bp:低鹽狀態(tài)下結(jié)合率高。pH值：pH<7.0:結(jié)合率高。應(yīng)用：從瓊脂糖凝膠中別離純化DNA片段；從DNA反響物中純化目的DNA片段，如回收純化PCR產(chǎn)物、酶切連接反響中的DNA片段；從探針制備反響中去除未標記上的核苷酸以及小的DNA片段〔比方引物〕；DNA濃縮，去鹽及去除雜質(zhì)。本方法的優(yōu)點：高純度：回收的DNA片段根本上不含RNA、蛋白質(zhì)及其它有機分子，可直接用于酶切、連接、探針制備、序列測定等；簡便：所需主要儀器是一架臺式離心機；快速：整個回收過程只需半個小時；高效：回收效率到達70%以上；多用途：可以用于膠回收、PCR產(chǎn)物回收、DNA片段及探針的純化濃縮等；平安：不接觸苯酚、氯仿等有害物質(zhì)。實驗材料：

使用Omegabio-Tek膠回收試劑盒〔Ultra-SepGelExtractionKit〕Ultra-SepBindingBuffer300mlUltra-SepBeads5.5mlDNAWashBuffer2×80mlElutionBuffer60ml超純水無水乙醇方法和步驟：瓊脂糖/EB凝膠電泳別離DNA片段切取所要的DNA條帶溶解瓊脂糖/EB凝膠結(jié)合玻璃奶離心沉淀玻璃奶洗脫DNADNA產(chǎn)量和質(zhì)量測定

1．瓊脂糖/EB凝膠電泳別離DNA片段。2．紫外燈下切取所要的DNA條帶。3．將切下膠塊放入1.5mlEP管中，稱重，以確定膠條的體積。設(shè)定膠的密度為1g/ml，例如0.2g膠認為其體積為0.2ml。4.參加等體積的Ultra-SepBindingBuffer。 對長度低于400bp的DNA片段或大于2%瓊脂糖凝膠，參加3×體積的BindingBuffer。

方法和步驟：5．渦旋震蕩懸浮Ultra-SepBeads，參加10μlUltra-SepBeads到樣品EP管中。50～55℃溫育10min或時間至完全熔解。在溫浴過程中，每隔2min震蕩EP管懸浮Ultra-SepBeads。

注意觀察膠完全熔解后膠/BindingBuffer混合物的pH值。當混合物pH＞8.0那么DNA的產(chǎn)量將會顯著減少。如果混合物變?yōu)槌壬蚣t色，那么參加5μl5MNaAC〔pH5.2〕以降低pH值。參加NaAC后混合物的顏色應(yīng)該變?yōu)榈S色。6．10,000×g室溫離心1min，使Ultra-SepBeads沉淀，棄上清。7．參加300μlUltra-SepBindingBuffer，渦旋震蕩Ultra-SepBeads以洗滌玻璃奶。10,000×g室溫離心1min，棄上清。8．參加750μl預(yù)先按瓶上標簽說明用無水乙醇稀釋的DNAWashBuffer。渦旋震蕩重懸玻璃奶，10,000×g離心1min，沉淀玻璃奶。9．棄上清并徹底去除離心管剩余液體。空氣中枯燥5～10min。10．向管中參加15～50μl〔按最終產(chǎn)物濃度確定參加體積〕ElutionBuffer〔10mMTris，pH8.5〕。渦旋震蕩重懸沉淀，50℃水浴5min，10,000×g離心1min，沉淀玻璃奶。 如果用水洗脫DNA，確定水的pH值在7.5～8.0之間。11．小心將上清轉(zhuǎn)入另一EP管中，上清即含純DNA。約80～90%結(jié)合DNA被洗脫下來。12.DNA產(chǎn)量和質(zhì)量測定： 適當稀釋DNA，測定A260及A280。按照計算公式計算DNA濃度： DNA濃度=吸光度260x50x稀釋倍數(shù)mg/ml DNA純度=A260/A280,＞1.8說明樣品核酸純度＞90%。本卷須知：DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應(yīng)使用長波紫外燈，切膠時間盡量短。DNA洗滌液應(yīng)保持在低溫，否那么可能使DNA從玻璃奶上脫落而導(dǎo)致回收率降低。

最后洗脫前盡量去除管壁和管底殘留的洗滌液，否那么可能導(dǎo)致結(jié)合的DNA無法洗脫或洗脫液含有雜質(zhì)，影響繼后操作。第二局部質(zhì)粒DNA的連接和轉(zhuǎn)化實驗?zāi)康牧私庵亟MDNA分子連接及轉(zhuǎn)化大腸桿菌的原理與根本操作方法。一、DNA分子的體外連接實驗原理DNA分子的體外連接：在一定條件下，由DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5’端磷酸基團與3’端羥基，使二者之間形成磷酸二酯鍵的生物化學過程。DNA分子的連接是在酶切反響獲得同種酶互補序列根底上進行的。DNA連接酶常用的DNA連接酶:來自大腸桿菌的DNA連接酶來自噬菌體的T4DNA連接酶DNA連接酶作用機理〔T4DNA連接酶為例〕：T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物。酶-ATP復(fù)合物結(jié)合到具有5’-磷酸基和3’-羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化。產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來。T7DNAligaseT4DNAligase本卷須知連接反響的溫度：DNA連接酶的最適反響溫度為37℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定。不同公司生產(chǎn)的DNA連接酶的最正確連接溫度不同，對粘性末端與平末端的連接溫度也不同。連接效率：粘性末端效率高，平末端效率低，因而在底物濃度、酶濃度選擇上存在差異。提高連接效率的方法：提高DNA的濃度，增加重組子比例。缺點：會出現(xiàn)DNA自身連接問題，對于單酶切和平末端的DNA片段尤其如此。解決方法：對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其5’端的磷酸基，防止環(huán)化，通過連接反響后形成的缺口在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復(fù)。提高連接效率的方法：將連接液放置4℃過夜可以增加連接效果。連接反響結(jié)果檢測：轉(zhuǎn)化宿主菌，陽性克隆篩選。DNA凝膠電泳。實驗材料：純化后的酶切質(zhì)粒載體目的基因片段DNALigationMix〔Takara〕T4DNA連接酶緩沖液系統(tǒng)方法和步驟

反響體系：線性化載體pCDNA3〔EcoRI和XbaI酶切〕3μl〔~0.1μg〕3倍分子的目的基因p38片段〔EcoRI和XbaI酶切〕5μlDNALigationMix8μ總體積16μl蓋上管蓋，混勻，臺式離心機上離心５秒。24℃連接1-3小時。反響結(jié)束后于-20℃保存。

二、重組DNA的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選實驗原理:轉(zhuǎn)化(Transformation)：細菌細胞的生物學特性由于吸收外源DNA發(fā)生可遺傳的改變。重組DNA轉(zhuǎn)化：DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。感受態(tài)(Competence)：通過人工誘導(dǎo)的方法，使自然狀態(tài)下無法發(fā)生轉(zhuǎn)化的細菌，如大腸桿菌，處在易于接受外源DNA分子的狀態(tài)即感受態(tài)，從而使轉(zhuǎn)化得以高效率地進行。轉(zhuǎn)化子(Transformant)：即轉(zhuǎn)化后的受體菌,又叫重組子。重組子在培養(yǎng)環(huán)境中形成的克隆稱為陽性克隆，外源DNA可在陽性克隆中大量擴增、繁殖、保存以及表達目的基因產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌：DNA分子轉(zhuǎn)化步驟：吸附：雙鏈DNA分子吸附于受體菌外表；轉(zhuǎn)入：雙鏈DNA分子解鏈，一條鏈進入受體菌，另一條降解；自穩(wěn)：外源質(zhì)粒DNA分子的細胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；表達：供體基因隨同復(fù)制子同時復(fù)制、分裂、轉(zhuǎn)錄翻譯。轉(zhuǎn)化效率：105~107轉(zhuǎn)化子/μgDNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵是感受態(tài)細菌的制備。感受態(tài)細胞能接受外來DNA分子的機制局部原生質(zhì)體化假說——細胞外表的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，使DNA分子能通過質(zhì)膜進細胞。證據(jù)有：發(fā)芽的芽孢桿菌容易轉(zhuǎn)化；大腸桿菌的原生質(zhì)體不能被噬菌體感染，卻能受噬菌體DNA轉(zhuǎn)化；適量的溶菌酶能提高轉(zhuǎn)化率。

酶受體假說——感受態(tài)細胞的外表形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。證據(jù)是：蛋白質(zhì)合成的抑制劑如氯霉素，可以抑制轉(zhuǎn)化作用；細胞分裂過程中，一直有局部原生質(zhì)化，但感受態(tài)只在生長對數(shù)期的中早期出現(xiàn)；別離到感受態(tài)因子，能使非感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺芗毎?/p>

轉(zhuǎn)化子的篩選方法：插入失活法抗性篩選藍白篩選(α互補法)雜交篩選免疫學篩選酶切圖譜鑒定菌落PCR鑒定常用方法：抗性篩選法：菌株為某種抗性缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因〔如氨芐青霉素、卡拉霉素等〕，這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。α互補法：許多載體〔如pUC系列〕含有一個大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacz基因)的短區(qū)段，其中含有l(wèi)acz的調(diào)控序列和頭146個氨基酸編碼區(qū)，這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。而受體菌那么含編碼β-半乳糖苷酶C端氨基酸的序列。當沒有外源基因插入時，二者融為一體后，有β-半乳糖苷酶表達，它能水解培養(yǎng)基中生色底物—5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷〔X-gal〕形成藍色菌落。而當有外源基因插入到多克隆位點，造成插入失活，從而使lacz基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同可以區(qū)分重組子和非重組子。X-gal+IPTG+AMPwithlacZ=bluecolony實驗材料

LB培養(yǎng)基質(zhì)粒pCDNA3-p38連接產(chǎn)物〔含Amp抗生基因〕CaCl20.1MAmpDH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞制備1.將宿主菌DH5大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37℃培養(yǎng)16～20h。2.挑取單菌落轉(zhuǎn)入20mlLB培養(yǎng)基錐瓶中，37℃震蕩過夜。3.從中取2ml菌液轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)4～5h，測A600達0.4～0.5。4.培養(yǎng)物冰上放置10min。5.轉(zhuǎn)入一50ml離心管，于4000rpm下4℃離心10min。6.棄上清，倒置離心管1min，流盡剩余殘液然后參加10ml用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上10min。7.5000rpm4℃離心10min，棄上清。8.參加300μl0.1mol/LCaCl2懸浮細胞，于4℃過夜。轉(zhuǎn)化

1.在1.5mlEppendorf管中參加100μl感受態(tài)細胞和10μlpCDNA3-p38DNA連接反響液，溫和混勻，置冰上30分鐘。2.42℃水浴45~60秒。3.立即冰浴2分鐘。4.參加900μlLB培養(yǎng)液，37℃孵育60分鐘。5.10000rpm離心15秒，吸去800上清。用剩余200μl上清輕柔懸浮細胞。6.接種轉(zhuǎn)化的細胞。7.37℃培養(yǎng)12~16小時，觀察結(jié)果。注意事項1.感受態(tài)細胞必須