革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓

關(guān)于革蘭氏染色及鏡檢操作規(guī)范培訓一、革蘭氏染色法革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

第2頁,共29頁，星期六，2024年，5月細菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，革蘭氏陽性菌（G+）不被脫去，革蘭氏陰性菌（G-）可被脫去。為觀察方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進行復(fù)染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。第3頁,共29頁，星期六，2024年，5月有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)的球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏陽性反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞桿菌都呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

第4頁,共29頁，星期六，2024年，5月G+和G-生物學特性的差異

比較項目G+細菌G-細菌革蘭氏染色反應(yīng)能阻留結(jié)晶紫而染成紫色可經(jīng)脫色而復(fù)染成紅色肽聚糖厚，層次多薄，一般單層磷壁酸多數(shù)含有無外膜無有脂多糖（LPS）無有類脂和脂蛋白含量低（僅抗酸性細菌含有類脂）高鞭毛結(jié)構(gòu)基體上著生2個環(huán)基體上著生4個環(huán)產(chǎn)毒素以外毒素為主以內(nèi)毒素為主對機械力的抗性強弱第5頁,共29頁，星期六，2024年，5月陰性菌陽性菌第6頁,共29頁，星期六，2024年，5月二、革蘭氏染色原理G+菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)程度大，故經(jīng)酒精脫色，失水而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故酒精處理，能把結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其保持紫色。第7頁,共29頁，星期六，2024年，5月G-菌因其細胞壁薄，外膜層類脂含量高，肽聚糖層薄且交聯(lián)程度低（松疏），經(jīng)酒精脫色后，以類脂為主的外膜迅速溶解，這時薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物的溶出，因此細胞退成無色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使G-菌呈紅色。第8頁,共29頁，星期六，2024年，5月三、儀器設(shè)備、試劑生物顯微鏡載玻片草酸銨結(jié)晶紫染色液革蘭氏碘液沙黃復(fù)染液或番紅染色液95%乙醇第9頁,共29頁，星期六，2024年，5月5、革蘭氏染色液配制5.1草酸銨結(jié)晶紫染液

A液：結(jié)晶紫2g

，95%乙醇20mL。B液：草酸銨0.8g，

蒸餾水80mL

混合A液及B液，靜置48h后使用。第10頁,共29頁，星期六，2024年，5月5.2碘液配制

碘片1g，

碘化鉀2g

，蒸餾水300mL

配制方法：先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，加夠蒸餾水即可。第11頁,共29頁，星期六，2024年，5月5.3番紅復(fù)染液配制番紅2.5g，

95%乙醇100mL

取上述配好的番紅乙醇溶液10mL與80mL蒸餾水混勻既成。第12頁,共29頁，星期六，2024年，5月四、操作方法1、制片在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水。用接種環(huán)進行無菌操作，挑取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層。第13頁,共29頁，星期六，2024年，5月為避免因菌數(shù)過多聚成團，不利觀察個體形態(tài)，可在載玻片之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進行稀釋，涂布成薄層。若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物沖洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可第14頁,共29頁，星期六，2024年，5月2、自然干燥涂片最好在室溫下使其自然干燥。有時為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時間過長，以防標本烤枯而變形。第15頁,共29頁，星期六，2024年，5月3、固定標本干燥后即進行固定，固定的目的：１）殺死微生物，固定細胞結(jié)構(gòu)。２）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。３）改變?nèi)玖蠈毎耐ㄍ感?，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。第16頁,共29頁，星期六，2024年，5月手執(zhí)載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上。在酒精燈外焰盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。第17頁,共29頁，星期六，2024年，5月4、初染滴草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘蒸餾水沖洗。第18頁,共29頁，星期六，2024年，5月5、媒染加革蘭氏碘液染1分鐘蒸餾水沖洗，用吸水紙吸去水分。第19頁,共29頁，星期六，2024年，5月6、脫色加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進行脫色，30秒后立即用蒸餾水沖洗。用吸水紙吸去水分。第20頁,共29頁，星期六，2024年，5月7、復(fù)染蕃紅染色液（?。ɑ蛏滁S）復(fù)染液染1分鐘后，用蒸餾水沖洗，并自然干燥。鏡檢。

第21頁,共29頁，星期六，2024年，5月五、鏡檢及結(jié)果判定接通顯微鏡的電源，調(diào)節(jié)光線的強度。將載玻片放在載物臺上，調(diào)節(jié)鏡頭至油鏡鏡頭處，調(diào)節(jié)粗準焦螺旋和細準焦螺旋至清晰為止。觀察菌落形態(tài)及菌體的顏色。革蘭氏陽性菌染色呈紫色，革蘭氏陰性菌染色呈紅色。

第22頁,共29頁，星期六，2024年，5月六、革蘭氏染色圖片第23頁,共29頁，星期六，2024年，5月革蘭氏染色的大腸桿菌革蘭氏染色的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌第24頁,共29頁，星期六，2024年，5月革蘭染色的傷寒沙門菌革蘭染色的福氏志賀菌第25頁,共29頁，星期六，2024年，5月七、革蘭氏染色注意事項標本涂片不能太厚，若涂片較厚，應(yīng)延長脫色時間，直至不在出現(xiàn)紫色為止。染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后，應(yīng)吸去玻片上的殘水。第26頁,共29頁，星期六，2024年，5月選用培養(yǎng)物時，G+菌培養(yǎng)12h-16h，G-培養(yǎng)24h。菌齡太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。第27頁,共29頁，星期六，2024年，5月革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是脫色時間。如脫色過度，革蘭氏陽性菌也