革蘭氏染色法

關(guān)于革蘭氏染色法一目的要求：

1、學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。

2、了解革蘭氏染色法的原理極其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二基本原理：革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家ChristainGran創(chuàng)立的，基本步驟是：

1、初染：結(jié)晶紫染色

2、媒染：碘液媒染

3、脫色：乙醇脫色

4、復(fù)染：番紅復(fù)染第2頁,共15頁，星期六，2024年，5月

經(jīng)此法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而染上復(fù)染劑的顏色（紅色）的細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。GramstainofGram-GramstainofGram+第3頁,共15頁，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌對革蘭氏染色的不同反應(yīng)是由于它們細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同而造成的。初染后，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物，增強(qiáng)染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時，革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇脫色時細(xì)胞壁脫水，使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔經(jīng)縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂質(zhì)含量高，所以當(dāng)脫色處理時，類脂質(zhì)被乙醇溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫—碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。第4頁,共15頁，星期六，2024年，5月StructureofaGram-NegativeCellWallStructureofaGram-PositiveCellWall

第5頁,共15頁，星期六，2024年，5月

三、器材：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，革蘭氏染色液，載玻片，顯微鏡等四、操作步驟：

1、涂片：將大腸桿菌（24h）和金黃色葡萄球菌（24h）分別涂片、干燥、固定。

2、染色：（1）初染：加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗（2）媒染：滴加碘液沖去殘水，并覆蓋一分鐘，水洗（3）脫色：將水甩凈，并襯以白背景，用95%乙醇滴洗至剛剛無紫色為止，約20—30秒，立即用水沖凈乙醇（4）復(fù)染：用番紅液染1--2分鐘，水洗第6頁,共15頁，星期六，2024年，5月3、鏡檢：干燥后，油鏡觀察。以分散開的細(xì)菌顏色為準(zhǔn)，革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。4、混合制片觀察：一載玻片上兩種菌混合制片，對比觀察。第7頁,共15頁，星期六，2024年，5月步驟1：涂片

第8頁,共15頁，星期六，2024年，5月步驟2：干燥

第9頁,共15頁，星期六，2024年，5月步驟四染色

步驟三固定第10頁,共15頁，星期六，2024年，5月crystalvioletstainwashwithwater

結(jié)晶紫染色水洗第11頁,共15頁，星期六，2024年，5月Stainwithgram'siodinesolution

碘液復(fù)染Decolorizebyadding95%alcohol95%酒精脫色第12頁,共15頁，星期六，2024年，5月CounterstainwithSafranin沙黃復(fù)染Resultsofstain染色結(jié)果第13頁,共15頁，星期六，2024年，5月五注意事項(xiàng)

1）注意涂片不宜過。

2）火焰固定溫度要適宜。

3）注