高效液相色譜法測定S-誘抗素及對其設(shè)計濃度驗證

抗素的高效液相色譜檢測方法，采用Pgrandsil-STC-C??分離，紫外檢測器檢測，以甲醇＋甲酸水溶液為流動相，在260

nm波長條件下測定S-誘抗素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在質(zhì)量濃度為1.0～100.0mg/L時，S-誘抗素線性關(guān)系良好，回收率為100.08%～100.40%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08～3.33，變異系數(shù)為0.88。98%

S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗、溞類急性活動抑制試驗和魚類急性毒性試驗結(jié)果表明供試物的實測濃度均不低于設(shè)計濃度的80%，可用設(shè)計濃度計算EC??值和LC??值。農(nóng)藥對控制作物病害、保證農(nóng)作物的高產(chǎn)豐收發(fā)揮著重要作用，但農(nóng)藥的不合理使用也會對生態(tài)環(huán)境造成危害。農(nóng)藥進(jìn)入田間后，一部分會通過不同環(huán)境介質(zhì)匯集到水體中，降低水生生態(tài)環(huán)境的質(zhì)量，影響水生生態(tài)系統(tǒng)，甚至影響整個生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能。在我國，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)仍離不開農(nóng)藥。為了將農(nóng)藥使用造成的危害與風(fēng)險降到最低，對農(nóng)藥進(jìn)行毒性檢測已經(jīng)成為評價水環(huán)境質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。目前，生態(tài)風(fēng)險評價已成為農(nóng)藥環(huán)境安全管理的有力技術(shù)支撐，是我國農(nóng)藥登記管理中必不可少的環(huán)節(jié)。

斜生柵藻（Scenedesmusobliquus）是水體的初級生產(chǎn)者，它對生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定起著十分重要的作用。大型溞（Daphniamagna

Straus）屬于浮游甲殼類動物，以藻類為食，是水生生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的重要環(huán)節(jié)。因其生活周期短、繁殖快、對毒物敏感及易于在實驗室培養(yǎng)等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于水體環(huán)境污染監(jiān)測與水生生物毒性試驗和評價中。魚類是水生生態(tài)系統(tǒng)的消費者，在食物鏈上與人類的關(guān)系最密切。斑馬魚（Barchydaniorerio

var）是一種小型熱帶淡水魚，因其價格低廉、容易獲得、管理飼養(yǎng)易行等諸多因素引起環(huán)保組織重視，現(xiàn)已經(jīng)將化學(xué)品對其急性、慢性毒性作為評價污染物對水生環(huán)境危害程度的指標(biāo)。

S-誘抗素（abscisicacid）是活性高、功能強大的植物內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。其具有調(diào)節(jié)植物生長、改善農(nóng)作物品質(zhì)、提高作物生存能力等特性，廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的抗災(zāi)減災(zāi)、生態(tài)植被建設(shè)和農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)等領(lǐng)域。

關(guān)于S-誘抗素對3種水生生物的環(huán)境毒性評價尚未見報道，本試驗根據(jù)國家《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則》研究S-誘抗素對3種水生生物的抑制作用。

1

材料與方法1.1

儀器與試劑1200HPLC高效液相色譜儀、KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器、QUINTIX125D-1CN型十萬分之一電子天平、甲醇、98%

S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2

溶液配制準(zhǔn)確稱取98%

S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)樣品0.02551g于小燒杯中，加入甲醇，移至50mL容量瓶，定容，得500.0mg/L的S-誘抗素儲備液。用甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度為100.0mg/L、50.0mg/L、20.0mg/L、10.0mg/L、2.0mg/L、1.0mg/L的S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.3

水樣采集與處理藻類生長抑制試驗各濃度處理重復(fù)3次，分別于0h、72h在水體中部取樣；溞類急性活動抑制試驗各濃度處理重復(fù)4次，分別于0h、48h水體中部取樣；魚類急性毒性試驗各濃度處理重復(fù)3次，分別于0h、96h水體中部取樣，重復(fù)混合后過0.22

μm水系濾膜，直接進(jìn)樣，分別檢測不同時間水中樣品含量。1.4

HPLC液相色譜條件液相色譜柱：Pgrandsil-STC-C18（250mm×4.6

mm，5

μm）；流動相：甲醇＋水（體積比60∶40），甲酸調(diào)節(jié)溶液pH值為3；檢測波長：260nm；柱溫：25℃，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：20

μL。所用試劑和溶液進(jìn)入色譜系統(tǒng)前經(jīng)0.22

μm微孔濾膜過濾。1.5

測定在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，計算各針相對響應(yīng)值的重復(fù)性，待相鄰2針S-誘抗素響應(yīng)值變化≤1.5%時，再按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

1.6

數(shù)據(jù)處理將待測樣品溶液的峰面積值代入下列公式計算，得溶液中的有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：X為待測樣品溶液中有效成分質(zhì)量濃度，單位為mg/L；C為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中有效成分質(zhì)量濃度，單位為mg/L；S1為待測樣品溶液峰面積值；S2為標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液峰面積值。2

結(jié)果與討論2.1

方法的線性關(guān)系S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖顯示，出峰時間為9.283min。以S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，S-誘抗素線性回歸方程為y=100,982x＋6,935.1，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。試驗結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為1.0～100.0mg/L時，S-誘抗素的質(zhì)量濃度與相應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好（圖1）。

（a）

（b）圖1

S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（a）及標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）2.2

精密度、準(zhǔn)確度的測定試驗期間，空白對照中未檢測出待測樣品。精密度的測定方法為：稱取空白樣品1.0g，分別加入質(zhì)量濃度為2.0mg/L的S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定3次。結(jié)果表明，S-誘抗素的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86，變異系數(shù)為0.88%（表1）。表1

98%

S-誘抗素原藥精密度測定結(jié)果

準(zhǔn)確度測定方法為：稱取空白樣品1.0g，分別加入質(zhì)量濃度為2.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L

3個添加水平的S-誘抗素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加水平下每個樣品平行測定2次。結(jié)果表明，S-誘抗素平均添加回收率為100.08%～100.40%（表2）。表2

98%

S-誘抗素原藥準(zhǔn)確度測定結(jié)果

2.3

藻類生長抑制試驗水樣檢測結(jié)果在98%

S-誘抗素原藥對藻類生長抑制試驗期間，設(shè)計質(zhì)量濃度為2mg/L、3mg/L、4.5mg/L、6.75mg/L、10.125mg/L、15.188mg/L時，S-誘抗素72h實測濃度與設(shè)計濃度比值為91.35%～94.68%。結(jié)果表明，S-誘抗素72h的實測濃度均高于設(shè)計濃度的80%，因此該設(shè)計濃度可用于計算藻類生長抑制EC50值（表3）。表3

藻類生長抑制試驗各處理藥液濃度測量數(shù)據(jù)

2.4

溞類急性活動抑制試驗水樣檢測結(jié)果在98%S-誘抗素原藥對溞類急性活動抑制試驗期間，當(dāng)設(shè)計質(zhì)量濃度為8mg/L、12mg/L、18mg/L、27mg/L、40.5mg/L、60.75mg/L時，S-誘抗素48h實測濃度與設(shè)計濃度比值為92.77%～95.42%。結(jié)果表明，供試物48h實測濃度均高于設(shè)計濃度的80%，因此此設(shè)計濃度可用于計算溞類急性活動抑制EC50值（表4）。表4

溞類急性活動抑制試驗各處理藥液濃度試驗數(shù)據(jù)

2.5

斑馬魚急性毒性試驗水樣檢測結(jié)果在98%

S-誘抗素原藥對斑馬魚急性毒性試驗期間，設(shè)計質(zhì)量濃度為100mg/L時，0h、96h實測濃度與設(shè)計濃度比值分別為98.646%和96.673%。結(jié)果表明，供試物96h的實測濃度均高于設(shè)計濃度的80%，因此可用設(shè)計濃度為100mg/L來計算溞類急性活動抑制LC50值（表5）。表5

斑馬魚急性毒性試驗各處理藥液濃度實驗數(shù)據(jù)

3

結(jié)論本研究采用高效液相色譜法，以甲醇＋水（體積比為60∶40）為流動相，使用Pgrandsil-STC-C18液相色譜柱