化學品 EASZY試驗 利用轉基因 tg（cyp19a1b：GFP）斑馬魚胚胎通過雌激素受體檢測內分泌活性物質

1化學品EASZY試驗利用轉基因tg（cyp19a1b：GFP）斑馬魚胚胎通過雌激素受體檢測內分泌活性物質本文件規(guī)定了化學品EASZ試驗利用轉基因tg（cyp19a1b：GFP）斑馬魚胚胎通過雌激素受體篩選內GB/T21802化學品快速生物降解性改進的MITI試GB/T21803化學品快速生物降解性DOGB/T21831化學品快速生物降解性密閉瓶法GB/T21855化學品與pH有關的GB/T21856化學品快速生物降解性二氧化碳產生試驗GB/T21857化學品快速生物降解性改進的OECDGB/T27850化學品快速生ISO6341水質-對大型溞（枝角目，甲殼綱）的活動抑制試驗-急性毒性試驗（WaterQuality-OECD化學品測試導則No.23難測試化學品水相水生毒性試驗指導文件（GuidanceDocumentonAqueous-PhaseAquaticToxicityTestingofDifficultTestChemicalinTheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuOECD化學品測試導則No.112水中的解離常數(shù)（DissociationConstantsinOECD化學品測試導則No.236魚類胚胎急性毒性試驗（FishEmbryoAcuteToxicit2一種能與激動劑配體結合，并阻斷或抑制該配體介導反應的化雌激素活性estrogenicac受試物模擬17β-雌二醇作用的能力，以雌激素受體特異性的方式激活內源性cyp19a1b和/或由用于表明實驗室具有標準化測試技術能力的一系3否能正確測定或預測所關注的生物學效應及其準確性。相關性考慮了通過試驗正確分類得到的所有陰性/非活性化學物質的比例，用于衡量產生分類結果的試驗方法的Dpf：受精后天數(shù)（Daypost-fertilizatDMSO：二甲基亞砜（DimethylSulfoxiEE2：17α-乙炔雌二醇（17α-ethinylestraE2：17β-雌二醇（17β-estraER：雌激素受體（EstrogenRecepERE：雌激素反應元件（EstrogenResponseElGFP：綠色熒光蛋白（GreenFluorescentProHpf：受精后的小時數(shù)（HourspostfertilizatioROI：感光區(qū)域（RegionofInte4實驗室應定期開展能力確認試驗，以驗證轉基因胚胎的響應性。每年用EE2或E2進行一次正式56.2×103.75×102.48×108.4×104×107.39×104.6×10 ））6轉基因純合子tg（cyp19a1b：GFP）品系的培養(yǎng)條件與野生型斑馬魚相同。轉基因成魚定期內交以魚與野生型斑馬魚進行一次異交。通過觀察攜帶該轉基因的后代中GFP的組成性表達，選擇轉基因胚胎采用未經化學品暴露的轉基因斑馬魚獲取魚卵。親魚在產卵前2個月不得接受任何藥物（急性或預h，推薦承載量為1尾魚/1L。將親魚飼養(yǎng)在活性炭過濾水通過親魚在大型水箱中集群產卵的方式采集轉基因斑馬魚卵。持續(xù)將60到100尾轉基因成年雄魚和蟲)無節(jié)幼體與適當大小的溞類。提供活食有利于環(huán)境豐容，因此應盡可能提供活食。在試驗前一天，利用雙目顯微鏡，選擇發(fā)育正常的受精卵，轉移到玻璃容器中，承載量為1個胚胎/使用合適的試驗用水，如重組水（ISO6341）或水質良好的地表水/井水。試驗前對試驗用水進行S/cm溫度（27℃±2℃)。7暴露容器置于人工氣候培養(yǎng)箱中，溫度為27℃±2℃,控制光周期（12h~16h光照：12h~8h如缺乏受試物相關急性毒性數(shù)據，應對斑馬魚tg（cyp19a1b：GFP）胚胎開展照只設置一個包含10個胚胎的平行。預試驗中每個暴露容器含有258驗溶液之前（24h±2h）測定其中一個平行，在暴露期間至少測定一次。受試物的穩(wěn)定性應在24h內保持在理論濃度的±20%范圍內?？稍谠囼為_始前用試驗溶液預處理試驗容器至少24h，以盡量減少吸果，胚胎觀察可參考OECDNo.236導則。孵化速率的延遲會減少魚類在受試物中的暴露，可限制EASZY一個24孔的熒光載玻片可以轉移同一濃度組的所有胚胎。此時可以麻醉胚胎管頂端重新定位胚胎，從背側觀察胚胎，過程中可以使用固定介質（如甲基纖維素)。在該發(fā)育階段，99數(shù)據分析和結果評價對每個胚胎進行圖像分析后，將結果記錄在數(shù)據表中。對斑馬魚個體熒光的定量以轉基因tg為了確定某種化學物質的潛在活性，通過方差分析（ANONA）對濃度組和對照組各個平行的效值進行比較。應對空白對照和溶劑對組（如有）之間的GFP采用適當?shù)慕y(tǒng)計方法進行分析,可參考OECD），如濃度-效應關系接近單調時,可用非參數(shù)統(tǒng)計方法如Jonckheere-Terpstra檢驗或Williams檢驗，分析統(tǒng)計流程圖見附錄I。其他更多關于生態(tài)毒性數(shù)據統(tǒng)計的分析方如果有活性則表明其為雌激素。這有助于避免EASZY試驗中潛在的假前期的驗證試驗結果為EASZY試驗方法的可靠性、準確性和穩(wěn)定性提供了依據，它表明受試物的雌c)試驗結束時，空白對照組和溶劑對照組（如有）；）；——應根據有效性和判定標準來解釋受試物的潛在雌激素活性，并對結果進行討論；——如果試驗濃度的數(shù)量允許建立完整的濃度-效應曲線，可推導引起最大效應50%的濃度AI）和20bp的未翻譯外顯子II（exonII后面是天然翻譯起始位點。將含有SV40polyA序列的GFP根據受試物誘導GFP表達（受斑馬魚雌激素受體調控cyp19a1b啟動子驅動）的能力來揭示該化學品固醇生成途徑轉化為已知的具有雌激素活性的DHT代謝物5α-雄甾烷-3β和17β-二醇(β-二醇）。一系列天然與合成激素以及屬于不同化學家族的化學品誘導GFP的能力，已經在轉基因tg實驗室間比對驗證試驗表明，化合物作為激動劑直接與雌激素受體結合，通過特（ER-specific）的方式誘導了GFP。EASZY試驗可以測定和分辨從低濃度（ng/L）到也不涉及雄激素應答元件，而是由于睪酮和甲基睪酮分別芳香化為雌二醇（estradiol）和甲雌二醇雌激素受體非雄激素受體存在的情況下。相反，另一種非芳香化雄激素11酮-睪酮（11C.2使用助溶劑時試驗溶液的詳細制D.196h暴露后載有轉基因斑馬魚），圖E.1不同GFP表達水平的存活轉基因tg（cyp19a1b：G圖E.2暴露于溶劑DMSO和14.8nh強度應恒定。可以在一系列測定的前后使用熒光校分析工作已經完全自動化，以實現(xiàn)在短時間內分析大量的圖像。這些圖像分析通過一個免費的專門為圖像分析的一個關鍵標準是灰度閾值?；叶乳撝祵粋€能使報告熒光蛋白產生的熒光與魚體的自體熒光（背景熒光）區(qū)分開的灰度值。為了確定這個參數(shù)，需建立以下程序。灰度閾值一旦確定，將只分析灰度高于閾值的像素。這個閾值對于每臺熒光顯微鏡設備都是不隨時間改變，但當熒光設備發(fā)生變化時，如安裝一個新的光源時，灰度閾值可能會改變。使用EASZY_FAST宏所需的軟件有：a)ImageJ1.53或更高版本：https：///Download或https：///Fijic)Bio-Formats6.6.1或更高版本：/bio-formats/（用于讀寫生命科學圖像文件格式的庫）G.2.2“EASZY_FAST”宏的圖a)步驟1：批處理所選目錄——應用用戶定義的閾值（默認值為290），然后分析該閾值以上的片段；——將一個ROI中高于閾值的像素分組，并將該ROI保存在image目錄中的.zip文件中。b)步驟2：查看選定的ROI并測定——逐個打開圖像，查看自動選擇的ROI；——用戶可以確認ROI，在進一步的分析中直接修改它或刪除圖像。啟動ImageJ工具欄中的宏：插件（Plugins）\快速（Fast）\快速分析（FAST_Analyze）宏會提示選擇包含圖像文件的目錄。所選目錄和所有子目錄將被進行分析處該宏將顯示一個對話框，以設置分析選項：閾值（Thresholdvalue為像素強度設置較低置閾值。文件類型（Filetype）：在CZI，ZVI（蔡司視覺之后將顯示一個對話框（ROIcheck）來驗證ROI。手動（默認）或宏工具窗口中列出所有帶有文件名的測定圖像。該表可以自動保存為啟動時選擇的工作目錄中H.1由比對試驗獲得的溶劑、試驗用水和陽性對照中GFP測每個實驗室都報告了溶劑、試驗用水和與陽性對照（14.8ng/LEE2）的統(tǒng)計能力依然很高，能夠反映其檢驗對照組和試驗組之間差異的試驗2試驗2試驗2試驗2RawIntDen=胚胎熒光強度（基于圖像分析；見GFP（fold）=……（H.1）存活率（%）=在受精9活胚數(shù)×100……（H.2）孵化率（%）=在數(shù)×100………………（H.3）表H.2從EASZY試驗中收集的數(shù)據示例n117234567216234563162345611723456721723456731623456117234567217234567317234567表H.2從EASZY試驗中收集的數(shù)據示例（續(xù)）11723456721723456731723456711723456721723456731723456711723456721623456317234567表H.2從EASZY試驗中收集的數(shù)據示例（續(xù)）1172345672172345