馬鼻肺炎診斷技術(shù)-編制說明

一、工作簡況

（一）任務(wù)來源

馬鼻肺炎是由馬皰疹病毒（Equineherpesvirus,EHV）1型和4型引起馬屬

動(dòng)物的一種急性熱性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少、呼吸道癥狀、流產(chǎn)、

腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀。EHV-1主要引起妊娠母馬病毒性流產(chǎn)，還可引起輕微的呼

吸道癥狀、馬駒死亡、腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀，近年來由EHV-1引起的神經(jīng)癥狀

在世界各地的發(fā)生均有上升趨勢。2021年3月，歐洲爆發(fā)了數(shù)十年來最嚴(yán)重的

馬皰疹病毒1型疫情，歐洲十國取消了國際馬術(shù)聯(lián)盟（FEI）賽事。2022年3月，

美國加利福利亞州也爆發(fā)嚴(yán)重的馬皰疹病毒1型疫情。EHV-4主要引起馬傳染

性鼻肺炎，主要發(fā)生在于2歲以下幼駒，成年馬多呈良性經(jīng)過，偶爾可引起流產(chǎn)。

EHV-1和EHV-4均可通過呼吸道感染，但EHV-4感染僅局限于呼吸道，而EHV-

1可繼續(xù)感染淋巴細(xì)胞，引起病毒血癥，并且可擴(kuò)散到母畜子宮或者神經(jīng)系統(tǒng)從

而引起流產(chǎn)或神經(jīng)性疾病。與EHV-4相比，EHV-1對(duì)養(yǎng)馬業(yè)造成的損失更為嚴(yán)

重。

傳統(tǒng)的診斷采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病原后再進(jìn)行血清型鑒定。常用的血清學(xué)方法

主要有病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。血清學(xué)

方法優(yōu)點(diǎn)在于可以在較短時(shí)間內(nèi)得出診斷結(jié)果，但該方法也存在一定的局限性，

即只能針對(duì)機(jī)體與病毒作用產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測，這樣一來，檢測結(jié)果就會(huì)受到

免疫接種等許多因素的干擾。目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測技術(shù)的應(yīng)用日

漸增多，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與常規(guī)PCR相比，具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR

污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。

因此，根據(jù)全國動(dòng)物防疫工作的需要，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《關(guān)于下達(dá)

2022年第二批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計(jì)劃的通知》（國標(biāo)委發(fā)

[2022]22號(hào)）將《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》（20220547-T-326）列入2022年動(dòng)物衛(wèi)生

國家標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)項(xiàng)目清單，上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大

學(xué)和青島海關(guān)技術(shù)中心，多年來從事馬鼻肺炎的診斷、檢測和疫病防控研究工作，

于2021年向國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)申報(bào)了修訂國標(biāo)《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)

項(xiàng)目，并于2022年獲得了批準(zhǔn)（20220547-T-326）。

（二）起草單位

本標(biāo)準(zhǔn)由上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海

關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院共同起草。

王艷：標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)、實(shí)施，主持該項(xiàng)目的總

體方案設(shè)計(jì)研究和標(biāo)準(zhǔn)的編制。根據(jù)分工，定期組織會(huì)議調(diào)整工作進(jìn)度和工作方

式。全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的審閱、修訂工作，策劃和組織專家及試用單位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行審

閱和復(fù)核驗(yàn)證。

劉建華、朱來華、胡月、鄭曉龍、武彩紅、王群：項(xiàng)目技術(shù)部分執(zhí)筆起草人。

協(xié)助該標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目的總體方案設(shè)計(jì)研究以及組織實(shí)施。協(xié)助標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)報(bào)告、

附件等的審閱和修訂，負(fù)責(zé)相關(guān)技術(shù)文件的整理。負(fù)責(zé)診斷技術(shù)確立和標(biāo)準(zhǔn)化、

技術(shù)信息收集工作、資源調(diào)查工作。起草編制說明等相關(guān)文件，是技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化試

驗(yàn)的主要操作者。

馮之航、林穎崢、蔡一村、薛俊欣、張強(qiáng)：協(xié)助該標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目的總體方案

設(shè)計(jì)研究以及組織實(shí)施。協(xié)助相關(guān)技術(shù)文件的整理。負(fù)責(zé)部分相關(guān)技術(shù)文件的整

理及標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證。

（三）主要工作過程

2011年12月30日發(fā)布，2012年4月1日年施行的國家標(biāo)準(zhǔn)《馬鼻肺炎病

毒PCR檢測方法》只規(guī)定了馬鼻肺炎病毒的PCR檢測方法，由于在實(shí)際工作中

該方法應(yīng)用偏少，且顯著滯后于目前實(shí)際情況，上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫

技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院

經(jīng)過協(xié)商，起草修訂此標(biāo)準(zhǔn)。修訂過程主要分為資料收集分析階段、技術(shù)確立和

標(biāo)準(zhǔn)化階段、標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿研制階段和標(biāo)準(zhǔn)送審稿研制階段。各階段主要工作

過程分述如下：

技術(shù)路線：主要包括資料收集分析及技術(shù)確立與標(biāo)準(zhǔn)化階段、標(biāo)準(zhǔn)征求意見

稿階段、標(biāo)準(zhǔn)送審稿階段到最終形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿。

1、計(jì)劃階段

2022年初，是項(xiàng)目計(jì)劃階段。上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新

疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院組織相關(guān)主要

完成人員，成立了修訂《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目組。2022年1月至

2022年3月資料收集分析及技術(shù)確立與標(biāo)準(zhǔn)化階段：成立項(xiàng)目組，通過文獻(xiàn)、

標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢索，OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》，總結(jié)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T27621-

2011）存在的問題與不足，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中的核心技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及驗(yàn)證工作。

2、實(shí)施和完成階段

2022年4月至2023年6月，是項(xiàng)目實(shí)施和完成階段。

（1）標(biāo)準(zhǔn)“征求意見稿”階段：2022年4月-2022年12月，完成該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)

“征求意見稿”的編制。

（2）標(biāo)準(zhǔn)“送審稿”階段：2023年1月-2022年5月，完成標(biāo)準(zhǔn)所列主要

技術(shù)的復(fù)核試驗(yàn)后，按要求送有關(guān)專家征求意見，對(duì)專家的意見進(jìn)行匯總、整理，

參照反饋的意見對(duì)征求意見稿進(jìn)行細(xì)致入微的修訂形成標(biāo)準(zhǔn)“送審稿”報(bào)審。

（3）標(biāo)準(zhǔn)“報(bào)批稿”階段：2023年6月，根據(jù)審查意見對(duì)送審稿進(jìn)行修改，

完成標(biāo)準(zhǔn)“報(bào)批稿”。

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

國家標(biāo)準(zhǔn)《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》是根據(jù)我國當(dāng)前馬皰疹病毒1型和4型引起

的馬鼻肺炎的防制技術(shù)需要，在原有國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T27621-2011）《馬鼻肺炎病

毒PCR檢測方法》基礎(chǔ)上修訂的。旨在對(duì)該病的確診提供規(guī)范性技術(shù)及文件。

標(biāo)準(zhǔn)的編寫是按照GB/T1.1-2020進(jìn)行的。

（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)

《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》（GB/T27621-2011）是2011年12月發(fā)布的。該標(biāo)準(zhǔn)

所涉及的技術(shù)僅涉及普通PCR的檢測方法，已不能滿足當(dāng)前及今后一段時(shí)期我

國馬鼻肺炎診斷的技術(shù)需求。其主要缺陷為：（1）該診斷標(biāo)準(zhǔn)沒有病原分離，而

病原分離是該病診斷的傳統(tǒng)診斷方法之一；（2）該診斷標(biāo)準(zhǔn)中沒有實(shí)時(shí)熒光PCR

方法，而利用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)EHV-1和EHV-4型的檢測，進(jìn)行EHV-1和EHV-

4診斷，已得到國內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可；（3）該診斷標(biāo)準(zhǔn)缺少血清學(xué)方法，血

清學(xué)方法是診斷該病的重要的輔助技術(shù)，因此血清學(xué)檢測是診斷。此外，該診斷

標(biāo)準(zhǔn)沒有說明所列的檢測技術(shù)對(duì)該病的初步診斷和確診有何意義，也沒有給出該

病初步診斷和確診的判定依據(jù)。

本次對(duì)馬鼻肺炎診斷技術(shù)的修訂，目的有兩個(gè)：一是與國際標(biāo)準(zhǔn)基本保持一

致，改變國家標(biāo)準(zhǔn)顯著滯后于國際標(biāo)準(zhǔn)的狀況；二是將一些在國內(nèi)外經(jīng)過多年實(shí)

踐證明成熟可行的新技術(shù)納入進(jìn)來，改變?cè)袠?biāo)準(zhǔn)中檢測技術(shù)偏少、且顯著滯后

于實(shí)際應(yīng)用的狀況。

修訂后的標(biāo)準(zhǔn)分前言、范圍、規(guī)范性引用文件、縮略語、臨床癥狀、病毒分

離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光PCR檢測方法、PCR檢測

方法、綜合判斷和附錄等共12個(gè)部分。此標(biāo)準(zhǔn)修訂后，有利于我國馬鼻肺炎診

斷和監(jiān)測，也有利于提升國家標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)威性、實(shí)用性。

（三）制定本標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)

上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海關(guān)檢驗(yàn)檢

疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，一直致力于馬鼻肺炎的流行病學(xué)調(diào)查、診

斷和快速檢測技術(shù)研究，為本標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了良好的基礎(chǔ)。

（四）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1、EHV1和EHV4熒光PCR檢測方法；

2、EHV1和EHV4熒光PCR檢測方法的特異性；

3、EHV1和EHV4熒光PCR檢測方法的敏感性；

4、病毒分離的驗(yàn)證；

5、微量血清中和試驗(yàn)的驗(yàn)證。

（五）實(shí)際應(yīng)用效果

本標(biāo)準(zhǔn)在本實(shí)驗(yàn)室和3家外部實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行了驗(yàn)證和實(shí)際應(yīng)用，證實(shí)該標(biāo)

準(zhǔn)中的熒光方法特異、敏感、可滿足不同類型樣品的實(shí)際檢測需求，效果良好。

三、主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析、綜述報(bào)告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)

濟(jì)效果

（一）主要試驗(yàn)或驗(yàn)證的分析

3.1熒光PCR

3.1.1引物序列

EHV1F:GGGGTTCTTAATTGCATTCAGACC;

EHV1R:GTAGGTGCGGTTAGATCTCACAAG;

EHV1P:FAM-TCTCCAACGAACTCGCCAGGCTGTACCBHQ1;

EHV4F:TAGCAAACACCCACTAATAATAGCAAG

EHV4R:GCTCAAATCTCTTTATTTTATGTCATATGC

EHV4P:JOE-CGGAACAGGAACTCACTTCAGAGCCAGC-BHQ1

3.1.2熒光PCR方法的建立

獲得最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)后，通過對(duì)熒光PCR各條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了

最佳的反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)：95℃5min；95℃15s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)。退

火延伸時(shí)檢測熒光信號(hào)。

表1熒光定量RT-PCR反應(yīng)成份（20μL體系）

成份ddH2OBuffer上游引物下游引物探針模板

單位濃度2χ10μmol/L10μmol/L10μmol/L

加樣量(μL)6100.80.80.42

建立了檢測EHV-1和EHV-4的擴(kuò)增曲線（圖1）

圖1EHV-1和EHV-4擴(kuò)增曲線

3.1.3熒光定量PCR的敏感性

經(jīng)過檢測，EHV-1和EHV4熒光定量PCR的最低檢出限為分別為3拷貝數(shù)/uL

和30拷貝數(shù)/uL。

A

B

圖2EHV-1和EHV-4敏感性檢測結(jié)果

AEHV-1BEHV-4

3.1.4熒光定量PCR的特異性

對(duì)5份其他相關(guān)病原（EIV、EAV、EIA、AHV-1、BHV-1）進(jìn)行檢測，僅EHV-

1和EHV-4出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，其他病原未出現(xiàn)擴(kuò)增，表明該方法具有良好的特異

性。

圖4EHV-1和EHV-4特異性檢測

3.3病毒分離

3.3.1樣品采集

鼻咽拭子的處理：鼻咽拭子和3mL運(yùn)輸培養(yǎng)基放入滅菌的10mL注射器，

轉(zhuǎn)動(dòng)注射器活塞，將拭子中的液體擠到一滅菌試管中。擠出的液體一部分通過滅

菌的0.45μm薄膜濾菌器濾入第2支無菌試管，保存?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)物組織樣品的處理：將肝、肺等組織混合，在無菌玻璃平皿中用解剖剪將

組織塊剪碎成約1mm3的小塊，加入含抗生素（附錄A.1）的無血清培養(yǎng)基，于

組織研磨器中研磨，1000r/min離心10min，吸出上清，備用。

抗凝全血的處理：試管上下顛倒充分混合后，室溫靜置1小時(shí)以上，用PBS

按照1:1的比例稀釋，上下點(diǎn)掉混勻或用移液槍吹打混勻；在15mL離心管中，

先加入3mL充分混勻的Ficoll液（1.077密度），再沿著管壁小心加入2mL上

述稀釋后的血液，血液和Ficoll液分層明顯為成功；1500r/min離心25min后，

棄上清，吸取中間層的白色薄膜層，用10mLPBS洗滌獲得的單個(gè)核細(xì)胞，1500

r/min離心10min，棄上清，重復(fù)洗滌一次并重懸細(xì)胞備用。

3.3.2病毒分離

將處理好的樣品上清液或細(xì)胞懸液接種到已長成單層的RK-13細(xì)胞（EHV-1

型）或E-derm細(xì)胞（EHV-4型）37℃培養(yǎng)1h使病毒吸附。另設(shè)未接種的單層

細(xì)胞作為對(duì)照組，僅加培養(yǎng)基同時(shí)孵育。

病毒吸附后，除去接種物，用PBS沖洗兩次，添加維持液，置37℃培養(yǎng)，觀

察細(xì)胞出現(xiàn)病變的情況。

正常細(xì)胞圖細(xì)胞病變圖

抗凝血的病毒適用于EHV-1的鑒定。

3.3.3微量血清中和試驗(yàn)

3.3.3.1中和病毒滴度（TCID50）測定

3.3.3.1.1中和病毒制備

將保存于液氮中的標(biāo)準(zhǔn)種毒取出置于4℃緩慢融化，參考其他標(biāo)準(zhǔn)，將融

化的種毒用維持液作60倍稀釋后，取1mL接種于長滿單層RK-13細(xì)胞的細(xì)胞瓶

中，吸附1h。然后，先用維持液洗滌一次，再加入維持液，放置于37℃恒溫培

養(yǎng)箱中培養(yǎng)3648h，當(dāng)50%75%細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即可收獲病毒培養(yǎng)液，分裝

成1mL后凍存（-70℃以下）備用。

3.3.3.1.2病毒滴度測定

在微量細(xì)胞培養(yǎng)板（96孔）每孔加25uL細(xì)胞培養(yǎng)液，用病毒稀釋液將凍

存病毒做10-1,10-2……10-8系列稀釋，每一稀釋度的病毒接種八孔，每孔25uL。

正常細(xì)胞對(duì)照，四孔至八孔不加病毒，僅加25uL病毒稀釋液。每孔100UlRK-

13細(xì)胞或E-derm（5104/100uL）。置37℃培養(yǎng)，3d后初判，4-5d終判。如

細(xì)胞對(duì)照正常，接種病毒的細(xì)胞出現(xiàn)CPE（細(xì)胞圓縮、脫離、裂解），記錄試驗(yàn)

數(shù)據(jù)。根據(jù)Karber法計(jì)算該批病毒的毒價(jià)（半數(shù)組織感染量TCID50）。

3.3.3.1.3中和試驗(yàn)

1）在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加25μL無血清的MEM。取每一被檢血清25μL,加

于A排和B排兩重復(fù)孔內(nèi)。第1排作為血清毒性對(duì)照，第2排是被檢血清的第1次稀

釋。從B排開始向下做倍比稀釋，即混合后取25μL,加入下一孔，充分混合，同

法依次稀釋，直至最后一孔。每板可測定6個(gè)血清樣。

2）每孔加25μL適當(dāng)稀釋的EHV-1或EHV-4病毒（100TCID50/孔），A排除外。血

清的最終稀釋度在加入病毒后為1/4到1/256。

3）另取一對(duì)照板，應(yīng)包括滴定已知滴度的陰性和陽性馬血清對(duì)照、細(xì)胞對(duì)照、

病毒對(duì)照和用于計(jì)算實(shí)驗(yàn)中病毒精確用量的病毒滴定驗(yàn)證。

4）細(xì)胞培養(yǎng)板放置于5%CO237℃培養(yǎng)箱中孵育1h。

5）每孔加50uL備好的E-Derm或RK-13細(xì)胞懸液，5%CO237℃培養(yǎng)箱中孵育4～5

d。

6）顯微鏡下觀察CPE，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

3.3.3.2試驗(yàn)結(jié)果

陰性血清陽性血清對(duì)照細(xì)胞

2.8驗(yàn)證和技術(shù)復(fù)核

為驗(yàn)證及推廣應(yīng)用《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)，我們呼和浩特海關(guān)技術(shù)中心、

烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心、廣州海關(guān)技術(shù)中心3家實(shí)驗(yàn)室，對(duì)檢測方法的特異性和

檢測適用性進(jìn)行了驗(yàn)證和技術(shù)復(fù)核。

驗(yàn)證結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)中的熒光定量PCR方法可特異性檢出EHV-1和EHV-

4，且與其他常見動(dòng)物病毒無交叉反應(yīng)，證實(shí)該標(biāo)準(zhǔn)中的熒光定量PCR方法可滿

足診斷和檢測需求，效果良好。試驗(yàn)復(fù)核結(jié)果說明此熒光定量PCR方法可靠。

（二）預(yù)期的經(jīng)濟(jì)效果

本標(biāo)準(zhǔn)的方法可用于國內(nèi)動(dòng)物疫病防控部門和養(yǎng)殖企業(yè)進(jìn)馬鼻肺炎的疫情

監(jiān)測和快速診斷，節(jié)省檢測時(shí)間，降低檢測成本，有利于盡早采取防控措施，降

低經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)濟(jì)效益特別是社會(huì)效益顯著。同時(shí)也為馬鼻肺炎研究提供標(biāo)準(zhǔn)化

的檢測規(guī)程。

四、采用國際標(biāo)準(zhǔn)和國外先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)的程度

本標(biāo)準(zhǔn)的熒光PCR、病毒分離和中和試驗(yàn)規(guī)程基本參照OIE《陸生動(dòng)物診斷

試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》相關(guān)規(guī)程制定。

五、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

本標(biāo)準(zhǔn)的修訂與我國現(xiàn)行法律、法規(guī)及強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)無矛盾和沖突。

六、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)

在專家征求意見稿送出以后，得到了各位專家的肯定，征集的修改建議均未

對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)提出原則性的重大修改意見。針對(duì)審閱專家提出的建議，起草小組專門

進(jìn)行了研討，按照專家建議，對(duì)征求意見稿作了必要的修改、補(bǔ)充和刪節(jié)。對(duì)各

位專家提出的其它有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)構(gòu)的編排和文字表述的建議中，我們根據(jù)GB/T1.1-

2009的要求，對(duì)合理的建議均予以采納。

七、標(biāo)準(zhǔn)性質(zhì)（強(qiáng)制性，推薦性）的建議，特別是對(duì)建議批為強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)

的理由應(yīng)充分說明

建議本標(biāo)準(zhǔn)為推薦性標(biāo)準(zhǔn)。

八、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、

過渡辦法等內(nèi)容）

1、組織實(shí)施

標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布后，可通過相關(guān)部門組織宣貫，推薦給有相應(yīng)檢測設(shè)施和檢測項(xiàng)目

的國內(nèi)各級(jí)實(shí)驗(yàn)室使用。

2、技術(shù)措施

可以委托項(xiàng)目起草單位或其他相關(guān)單位組織技術(shù)培訓(xùn)的方式推廣應(yīng)用本檢

測標(biāo)準(zhǔn)。也可通過委托有資質(zhì)的單位組織相關(guān)檢測的能力驗(yàn)證活動(dòng)，通過能力驗(yàn)

證也就表明參試單位有能力開展相應(yīng)檢測項(xiàng)目。

3、過渡辦法

由于熒光PCR技術(shù)在國內(nèi)已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用單位只需要一定的培訓(xùn)即可

掌握。因此可以預(yù)期，本標(biāo)準(zhǔn)一旦發(fā)布實(shí)施，很快即可實(shí)現(xiàn)平穩(wěn)過渡。建議本標(biāo)

準(zhǔn)自發(fā)布之日起實(shí)施。

九、廢止現(xiàn)行有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建議

無。

十、其他應(yīng)予說明的事項(xiàng)。

無。

一、工作簡況

（一）任務(wù)來源

馬鼻肺炎是由馬皰疹病毒（Equineherpesvirus,EHV）1型和4型引起馬屬

動(dòng)物的一種急性熱性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少、呼吸道癥狀、流產(chǎn)、

腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀。EHV-1主要引起妊娠母馬病毒性流產(chǎn)，還可引起輕微的呼

吸道癥狀、馬駒死亡、腦脊髓炎等神經(jīng)癥狀，近年來由EHV-1引起的神經(jīng)癥狀

在世界各地的發(fā)生均有上升趨勢。2021年3月，歐洲爆發(fā)了數(shù)十年來最嚴(yán)重的

馬皰疹病毒1型疫情，歐洲十國取消了國際馬術(shù)聯(lián)盟（FEI）賽事。2022年3月，

美國加利福利亞州也爆發(fā)嚴(yán)重的馬皰疹病毒1型疫情。EHV-4主要引起馬傳染

性鼻肺炎，主要發(fā)生在于2歲以下幼駒，成年馬多呈良性經(jīng)過，偶爾可引起流產(chǎn)。

EHV-1和EHV-4均可通過呼吸道感染，但EHV-4感染僅局限于呼吸道，而EHV-

1可繼續(xù)感染淋巴細(xì)胞，引起病毒血癥，并且可擴(kuò)散到母畜子宮或者神經(jīng)系統(tǒng)從

而引起流產(chǎn)或神經(jīng)性疾病。與EHV-4相比，EHV-1對(duì)養(yǎng)馬業(yè)造成的損失更為嚴(yán)

重。

傳統(tǒng)的診斷采用細(xì)胞培養(yǎng)分離病原后再進(jìn)行血清型鑒定。常用的血清學(xué)方法

主要有病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等。血清學(xué)

方法優(yōu)點(diǎn)在于可以在較短時(shí)間內(nèi)得出診斷結(jié)果，但該方法也存在一定的局限性，

即只能針對(duì)機(jī)體與病毒作用產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測，這樣一來，檢測結(jié)果就會(huì)受到

免疫接種等許多因素的干擾。目前，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測技術(shù)的應(yīng)用日

漸增多，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，與常規(guī)PCR相比，具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR

污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。

因此，根據(jù)全國動(dòng)物防疫工作的需要，國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《關(guān)于下達(dá)

2022年第二批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計(jì)劃的通知》（國標(biāo)委發(fā)

[2022]22號(hào)）將《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》（20220547-T-326）列入2022年動(dòng)物衛(wèi)生

國家標(biāo)準(zhǔn)立項(xiàng)項(xiàng)目清單，上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大

學(xué)和青島海關(guān)技術(shù)中心，多年來從事馬鼻肺炎的診斷、檢測和疫病防控研究工作，

于2021年向國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)申報(bào)了修訂國標(biāo)《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》標(biāo)準(zhǔn)

項(xiàng)目，并于2022年獲得了批準(zhǔn)（20220547-T-326）。

（二）起草單位

本標(biāo)準(zhǔn)由上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海

關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院共同起草。

王艷：標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的立項(xiàng)、實(shí)施，主持該項(xiàng)目的總

體方案設(shè)計(jì)研究和標(biāo)準(zhǔn)的編制。根據(jù)分工，定期組織會(huì)議調(diào)整工作進(jìn)度和工作方

式。全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的審閱、修訂工作，策劃和組織專家及試用單位對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行審

閱和復(fù)核驗(yàn)證。

劉建華、朱來華、胡月、鄭曉龍、武彩紅、王群：項(xiàng)目技術(shù)部分執(zhí)筆起草人。

協(xié)助該標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目的總體方案設(shè)計(jì)研究以及組織實(shí)施。協(xié)助標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)報(bào)告、

附件等的審閱和修訂，負(fù)責(zé)相關(guān)技術(shù)文件的整理。負(fù)責(zé)診斷技術(shù)確立和標(biāo)準(zhǔn)化、

技術(shù)信息收集工作、資源調(diào)查工作。起草編制說明等相關(guān)文件，是技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化試

驗(yàn)的主要操作者。

馮之航、林穎崢、蔡一村、薛俊欣、張強(qiáng)：協(xié)助該標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目的總體方案

設(shè)計(jì)研究以及組織實(shí)施。協(xié)助相關(guān)技術(shù)文件的整理。負(fù)責(zé)部分相關(guān)技術(shù)文件的整

理及標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證。

（三）主要工作過程

2011年12月30日發(fā)布，2012年4月1日年施行的國家標(biāo)準(zhǔn)《馬鼻肺炎病

毒PCR檢測方法》只規(guī)定了馬鼻肺炎病毒的PCR檢測方法，由于在實(shí)際工作中

該方法應(yīng)用偏少，且顯著滯后于目前實(shí)際情況，上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫

技術(shù)中心、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院

經(jīng)過協(xié)商，起草修訂此標(biāo)準(zhǔn)。修訂過程主要分為資料收集分析階段、技術(shù)確立和

標(biāo)準(zhǔn)化階段、標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿研制階段和標(biāo)準(zhǔn)送審稿研制階段。各階段主要工作

過程分述如下：

技術(shù)路線：主要包括資料收集分析及技術(shù)確立與標(biāo)準(zhǔn)化階段、標(biāo)準(zhǔn)征求意見

稿階段、標(biāo)準(zhǔn)送審稿階段到最終形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿。

1、計(jì)劃階段

2022年初，是項(xiàng)目計(jì)劃階段。上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心、新

疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心和江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院組織相關(guān)主要

完成人員，成立了修訂《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》國家標(biāo)準(zhǔn)的項(xiàng)目組。2022年1月至

2022年3月資料收集分析及技術(shù)確立與標(biāo)準(zhǔn)化階段：成立項(xiàng)目組，通過文獻(xiàn)、

標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢索，OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》，總結(jié)國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T27621-

2011）存在的問題與不足，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)中的核心技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及驗(yàn)證工作。

2、實(shí)施和完成階段

2022年4月至2023年6月，是項(xiàng)目實(shí)施和完成階段。

（1）標(biāo)準(zhǔn)“征求意見稿”階段：2022年4月-2022年12月，完成該項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)

“征求意見稿”的編制。

（2）標(biāo)準(zhǔn)“送審稿”階段：2023年1月-2022年5月，完成標(biāo)準(zhǔn)所列主要

技術(shù)的復(fù)核試驗(yàn)后，按要求送有關(guān)專家征求意見，對(duì)專家的意見進(jìn)行匯總、整理，

參照反饋的意見對(duì)征求意見稿進(jìn)行細(xì)致入微的修訂形成標(biāo)準(zhǔn)“送審稿”報(bào)審。

（3）標(biāo)準(zhǔn)“報(bào)批稿”階段：2023年6月，根據(jù)審查意見對(duì)送審稿進(jìn)行修改，

完成標(biāo)準(zhǔn)“報(bào)批稿”。

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和確定標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容的依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

國家標(biāo)準(zhǔn)《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》是根據(jù)我國當(dāng)前馬皰疹病毒1型和4型引起

的馬鼻肺炎的防制技術(shù)需要，在原有國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T27621-2011）《馬鼻肺炎病

毒PCR檢測方法》基礎(chǔ)上修訂的。旨在對(duì)該病的確診提供規(guī)范性技術(shù)及文件。

標(biāo)準(zhǔn)的編寫是按照GB/T1.1-2020進(jìn)行的。

（二）提出本標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)

《馬鼻肺炎診斷技術(shù)》（GB/T27621-2011）是2011年12月發(fā)布的。該標(biāo)準(zhǔn)

所涉及的技術(shù)僅涉及普通PCR的檢測方法，已不能滿足當(dāng)前及今后一段時(shí)期我

國馬鼻肺炎診斷的技術(shù)需求。其主要缺陷為：（1）該診斷標(biāo)準(zhǔn)沒有病原分離，而

病原分離是該病診斷的傳統(tǒng)診斷方法之一；（2）該診斷標(biāo)準(zhǔn)中沒有實(shí)時(shí)熒光PCR

方法，而利用實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)EHV-1和EHV-4型的檢測，進(jìn)行EHV-1和EHV-

4診斷，已得到國內(nèi)外很多實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可；（3）該診斷標(biāo)準(zhǔn)缺少血清學(xué)方法，血

清學(xué)方法是診斷該病的重要的輔助技術(shù)，因此血清學(xué)檢測是診斷。此外，該診斷

標(biāo)準(zhǔn)沒有說明所列的檢測技術(shù)對(duì)該病的初步診斷和確診有何意義，也沒有給出該

病初步診斷和確診的判定依據(jù)。

本次對(duì)馬鼻肺炎診斷技術(shù)的修訂，目的有兩個(gè)：一是與國際標(biāo)準(zhǔn)基本保持一

致，改變國家標(biāo)準(zhǔn)顯著滯后于國際標(biāo)準(zhǔn)的狀況；二是將一些在國內(nèi)外經(jīng)過多年實(shí)

踐證明成熟可行的新技術(shù)納入進(jìn)來，改變?cè)袠?biāo)準(zhǔn)中檢測技術(shù)偏少、且顯著滯后

于實(shí)際應(yīng)用的狀況。

修訂后的標(biāo)準(zhǔn)分前言、范圍、規(guī)范性引用文件、縮略語、臨床癥狀、病毒分

離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光