基因工程第七章-重組子的篩選和鑒定

第七章重組子的篩選和鑒定由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法，區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子、目的重組子與非目的重組子。重組子篩選和鑒定常用方法遺傳學(xué)檢測法核酸分子雜交檢測法物理檢測法外源基因產(chǎn)物檢測核酸序列分析及其他方法（一）、抗藥性標記及其插入失活篩選法pBR322質(zhì)粒上有兩個抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位點BamHI和SalI;Ampr上有插入位點PstI。第一節(jié)遺傳學(xué)檢測法1、原理：一、根據(jù)載體表型篩選pBR322（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：2、pBR322抗菌素標記選擇產(chǎn)生

-內(nèi)酰胺酶，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍灰色）褪色，變?yōu)榘咨?。抑制細菌生長，但不殺死細菌。殺死生長的細菌，但不殺死停止生長的細菌。（3）環(huán)絲氨酸：3、篩選方法：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌其生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活篩選法無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基（2）氨芐青霉素抗性插入失活篩選法如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。先將轉(zhuǎn)化液涂布含有Amp的平板；再將Amp平板上的轉(zhuǎn)化子影印至含有Tet的平板上；在Amp平板上生長、但在Tet

平板上不長的轉(zhuǎn)化子即含有目的重組子。（3）影印平板篩選法若在Tetr中插入外源DNA則：將外源DNA片段插在EcoRI位點，則：非重組子呈Ampr、Tetr

重組子呈Ampr、Tetr

將外源DNA片段插在BamHI位點，則：非重組子呈Ampr、Tetr

重組子呈Ampr、TetsApr顯色篩選法可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，也可區(qū)分重組子與非重組子。其原理是：載體分子上攜帶某種顯色酶基因，其表達產(chǎn)物能使細胞產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而易于辨認和挑選，如大腸桿菌質(zhì)粒pUC18攜帶的lacZ’基因（藍色反應(yīng)）、鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702攜帶的melC基因（黑色反應(yīng)）等。（二）、顯色篩選法1、基本原理將外源基因克隆在pUC18

的lacZ’標記基因內(nèi)部，使之滅活，此時重組子呈Apr、lacZ-，白色菌落；而非重組子則呈Apr、lacZ+，藍色菌落。將轉(zhuǎn)化后的受體細胞涂布在含有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后觀察菌落顏色。2、基本操作利用插入的外源基因的表達產(chǎn)物特性進行直接選擇轉(zhuǎn)化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。1、彌補缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長二、根據(jù)插入基因的表型篩選營養(yǎng)缺陷型篩選法小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）對三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。2、增加新性狀利用堿基配對原理進行的分子雜交是鑒定基因重組體的常用方法。雜交的雙方是待測的受體細胞基因片段與由插入片段基因制備的DNA或RNA探針。常用的篩選重組體的雜交方法有

1、菌落和噬菌斑原位雜交

2、斑點印跡雜交

3、R-環(huán)檢測

4、Southern印跡雜交

5、Northern印跡雜交第二節(jié)核酸分子雜交檢測法1、原位雜交篩選特點：對應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽性菌落。2、斑點印跡雜交3、R-環(huán)檢測法DNA-RNA雜交。（1）原理：（2）選擇過程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。缺點：需要電鏡！4、Southern印跡雜交Southernblot篩選結(jié)果5、Northernblotting用DNA（或RNA）探針檢測RNA樣品。主要檢測插入片段是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細胞中提取RNA，再用探針雜交。1、基本原理：質(zhì)粒的電泳速率與其分子量成反比，因此分離質(zhì)粒DNA并對其進行電泳，帶有外源基因的重組DNA分子的遷移率要低于無外源基因的質(zhì)粒分子。2、操作：將含有質(zhì)粒的單菌落細胞破碎，提取其質(zhì)粒DNA，用瓊脂糖凝膠電泳，觀察其電泳圖譜，判斷含有插入序列的重組質(zhì)粒。第三節(jié)物理檢測法—電泳檢測法一、直接電泳檢測法分子量Marker空載體重組克隆二、酶切電泳篩選法1、原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片段，再用其它酶切這個片段，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計的結(jié)果。ABA或B重組載體空載體不同克隆的酶切結(jié)果篩選過程三、PCR擴增檢測法1、原理PCR能在模板序列上擴增出預(yù)期DNA片段。2、過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片段引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長度是否與外源基因一致。是直接以轉(zhuǎn)化菌的單個克隆為模板，通過特異性引物或通用引物對插入載體中的目的基因快速擴增，用于鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的技術(shù)。與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，由于其具有快速、經(jīng)濟、簡便的特點而被廣泛用于轉(zhuǎn)化菌、特別是大量轉(zhuǎn)化子的鑒定和篩選。3、菌落PCR

操作步驟在PCR管中加7.5μL無菌水。為平板上將要挑取的菌落標上號碼（每組挑取8個菌落），用無菌牙簽挑選單菌落，將菌落轉(zhuǎn)至PCR管中（牙簽在無菌水中洗一下），然后將牙簽點在LB（+Amp）平板，記錄號碼。在PCR管中加其他成分（最后加酶）設(shè)定PCR程序，開始PCR。電泳檢測。LB平板過夜培養(yǎng)，選取正確的菌落。菌落PCR和常規(guī)PCR的比較菌落PCR：常規(guī)PCR：94℃

10min

94℃5min

94℃40s94℃40s62℃30s58℃30s72℃90s72℃90s25～30cycle

35～40cycle

72℃7min72℃7min4℃forever4℃forever預(yù)變性時間延長為10min,使得細菌能夠充分破裂，DNA大量釋放并充分變性。退火溫度由58℃提高到62℃是由于原來引物中的酶切位點和保護堿基與待擴增的基因是不配對的，現(xiàn)在配對的數(shù)量增多，退火溫度越高,特異性越強。循環(huán)次數(shù)減少是因為25～30個循環(huán)的擴增量足夠進行檢測，如果量太大跑出的電泳條帶呈現(xiàn)︼型，不易確定分子量。菌落PCR出現(xiàn)假陽性樣品污染、擴增試劑污染、擴增產(chǎn)物交叉污染等。常見的污染來源包括實驗室環(huán)境、加樣器、操作中形成的噴霧、試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西。菌落PCR出現(xiàn)假陰性避免將瓊脂培養(yǎng)基挑到PCR管中及其他原因:酶失活；引物質(zhì)量不好（設(shè)計、合成、保存）；物理原因（變性、退火的溫度、時間）。

一般重組子克隆的PCR反應(yīng)條帶比較亮且寬,形狀較規(guī)則,而假陽性和假陰性的PCR條帶，多數(shù)不太亮,條帶細而且不規(guī)則，有時拖尾。

設(shè)陰性對照操作過程：（1）菌落PCR完畢后電泳檢測帶型，在LB平板上挑選有正確帶型的菌落。（2）陽性克隆提取質(zhì)粒（3）酶切檢測條帶的分子量（4）測序，檢查點突變利用抗體作為“探針”來檢測轉(zhuǎn)入受體菌并且表達出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：一、放射性抗體檢測法第四節(jié)免疫化學(xué)檢測法1、抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對表達產(chǎn)物的檢測。蛋白—蛋白“雜交”待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標記的二抗固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標記的二抗結(jié)合蛋白125I標記的二抗①一種免疫血清含有多種IgG抗體，它們識別不同的抗原及其表位；②抗體分子能夠十分牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯）上，而不會被洗脫掉；③通過體外碘化作用，IgG抗體便會迅速地被放射性同位素125I標記上，制備二抗。2、基本原理3、放射性抗體檢測法過程4、Broome-Gilbert雙位點檢測法質(zhì)?；駻插入基因B表達質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白可用于檢測融合蛋白。既檢測外源基因產(chǎn)物又檢測載體基因產(chǎn)物。固相支持濾膜抗A抗體125I標記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光二、免疫沉淀檢測法把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當插入基因的表達產(chǎn)物被細菌分泌到菌落周圍時，就會與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。1、原理抗原—抗體沉淀反應(yīng)。主要檢測分泌型產(chǎn)物。2、方法對于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進行原位溶菌處理（溶菌酶）。三、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）Enzyme-linkedimmunosorbant

assay1、原理：一抗（primaryantibody）:與目的蛋白特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)，再通過比色測定有色物質(zhì)的含量（或吸光度），從而檢測目的蛋白的存在。待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶待測基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶2、ELISA檢測的一般步驟（1）固定樣品將待測樣品用包被液稀釋后加入96孔包被板的孔中，4℃、室溫或37℃濕盒內(nèi)包被過夜，抗原即可就被固定在孔底?？椎准尤胍豢?，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。（2）一抗結(jié)合一抗加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識別一抗。二抗上連著一種酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結(jié)合二抗加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。（4）顯色反應(yīng)在特殊的分光光度儀（酶標儀）上比色，打印出結(jié)果。（5）比色3、ELISA的局限性有效，但敏感性、特異性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）四、免疫印跡（westernblotting）法在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶。1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負電荷。（1）SDS:（SDS）：（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamide

gelelectrophoresis）在電場的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動，移動的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer點樣電泳方向（3）蛋白Marker已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓DaltonSDSPAGE（4）凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。②

轉(zhuǎn)到膜上進行染色。①

直接染色直接染色電泳結(jié)果2、Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、中性尼龍膜等）。（1）Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白Western裝置（2）Blotting原理與ELISA相同。待測蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物（顯色）PAGE膠待測蛋白辣根過氧化物酶：HRP①

先用一抗（待測蛋白的單克隆抗體）與膜上的蛋白結(jié)合。②

洗去未結(jié)合的一抗。③

用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRP）。④

清洗掉未結(jié)合的二抗。⑤

用顯色液（OPD）浸泡膜。⑥

加入水，終止反應(yīng)（3）Blotting過程（4）結(jié)果多克隆抗體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果第五節(jié)DNA序列分析法雙脫氧末端終止測序法的基本原理：

DNA序列測定是精確鑒定目的基因的重要手段，目前國際上流行采用Sanger發(fā)明的雙脫氧末端終止法測定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反應(yīng)的進程中，通過位點特異性終止測定DNA序列。雙脫氧末端終止測序法的基本操作：ssDNA

ssDNA

ssDNA

ssDNA

PrimerPrimerPrimerPrimerKlenowKlenowKlenowKlenowdNTPsdNTPsdNTPsdNTPsddATPddCTPddGTPddTTPA

G

T

C

DNA聚合反應(yīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳A

C

G

T

雙脫氧末端終止測序法的基本反應(yīng)：KlenowOH3'5'PTdNTP+ddATP

TTTTTOH3'5'PA

G

T

C

GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA引物DNA測序峰形圖一、無細胞翻譯系統(tǒng)第六節(jié)轉(zhuǎn)譯篩選法能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細胞提取物。如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細胞提取物系統(tǒng)。借助無細胞翻譯系統(tǒng)，通過表達或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。二、轉(zhuǎn)譯篩選mRNA無細胞翻譯系統(tǒng)35S標記的甲硫氨酸翻譯35S標記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影觀察放射性帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄是否與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符三、雜交抑制轉(zhuǎn)譯法mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體小亞基核糖體大亞基能翻譯mRNADNA核糖體小亞基核糖體大亞基不能翻譯1、原理2、過程四、雜交釋放轉(zhuǎn)譯法1、原理：將載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對應(yīng)的mRNA，進行體外翻譯。研究其轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫原性等）。2、過程硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA總mRNAcDNA基因的mRNA雜交洗脫cDNA基因的mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編碼的蛋白硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA硝酸纖維素濾膜載體和插入的cDNA收集35S標記的氨基酸第七節(jié)幾種常用的真核生物重組基因選擇方法真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolate

reductase，DHFR）哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的選擇標記1、胸苷激酶（thymidine

kinase,tk）（1）TK選擇原理①四氫葉酸的必要性DHFR②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類似物。能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dGTP和dTTP的合成：dUMPdTTPIMPdGTP氨甲喋啉抑制抑制dATP④胸苷酸激酶的補救作用TK+細胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成dTTP，存活。③次黃嘌呤的補救作用細胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dGTP。TtkdUMPdTTPIMPdGTP氨甲喋啉抑制抑制dATP補救培養(yǎng)基中的IMP①HAT培養(yǎng)基：TK-

細胞株。tk基因。②宿主細胞③載體標記（2）TK選擇過程含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入tk基因的細胞才能生存。G真核細胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。2、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）（1）選擇原理①二氫葉酸還原酶的必要性dUMPIMPdTTPdATP四氫葉酸dGTPDHFR+細胞二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補救！DHFR-

細胞DHFR-

細胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。需要補救！不能在無胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。②胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救dUMPdGTPdTTPdATP次黃嘌呤補救胸苷補救無四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補救:DHFR-細胞株（不能在無核苷酸的培養(yǎng)基中生長）。①宿主細胞（2）選擇過程透析除去血清中的內(nèi)源性核苷酸，以免補救。②無核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補救！DHFR+基因。③

載體標記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+livedie無核苷酸的培養(yǎng)基載體轉(zhuǎn)染是細菌抗生素，干擾細菌的核糖體，使細菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進行，但不影響真核生物