全血膽堿脂酶測定教材

全血膽堿酯酶活性的測定——三氯化鐵比色法實驗?zāi)康恼莆杖狢hE活性測定的意義掌握全血ChE活性測定原理、方法方法Asch-DTNB比色法（GBZ52）三氯化鐵比色法溴麝香草酚藍（B·T·B）比色法紙片法Biocheck法（便攜式分析儀）三氯化鐵比色法[原理]乙酰膽堿膽堿酯酶膽堿+乙酸堿性羥胺乙酰羥胺HClFeCl3羥肟酸鐵(棕紅色絡(luò)合物)三氯化鐵比色法[原理]血液中膽堿酯酶可使乙酰膽堿水解生成膽堿和乙酸，終止反應(yīng)后，剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺作用生成乙酰羥胺，然后在酸性環(huán)境中與三氯化鐵反應(yīng)生成棕紅色羥肟酸鐵絡(luò)合物。其顏色深淺與乙酰膽堿的量成正比，在520nm進行比色定量，從而推算出膽堿脂酶活性。實驗器材一次性注射器(1ml)12個，采血用；微量移液器（20μl）；分光光度計；玻璃比色杯(每組至少3個)；擦鏡紙；恒溫水浴箱（37℃±0.5℃）移液管(0.2ml，1ml，5ml)；試管；漏斗；容量瓶

試劑試劑均為分析純，水為蒸鎦水或去離子水。

1．磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.2準確稱取磷酸氫二鈉(Na2HP04·12H2O)16.72g和磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.72g，用水溶解并稀釋到1000ml，置4℃冰箱中保存。

2．堿性羥胺溶液臨用時將139g/L的鹽酸羥胺溶液與140g/L的氫氧化鈉溶液等體積混合。

3．鹽酸溶液1+2濃鹽酸l份加水2份混合。

試劑

4．三氯化鐵溶液(100g/L)稱取10g三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，加濃鹽酸0.84ml，溶解后再加水至100ml，貯存于棕色瓶中。

5．氯化乙酰膽堿標準溶液

(1)標準貯備液：精確稱取氯化乙酰膽堿1.2716g，用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至100ml。此溶液1ml含70μmol乙酰膽堿。置4℃冰箱內(nèi)保存。

(2)標準應(yīng)用液：取標準貯備液用磷酸鹽緩沖液稀釋10倍。此液1ml含7μmol乙酰膽堿，于臨用前配制。[分析步驟]1.乙酰膽堿標準曲線的繪制

2.樣品測定1.乙酰膽堿標準曲線的繪制（1）取六只具塞試管，配制不同濃度的乙酰膽堿溶液管號123456乙酰膽堿標準應(yīng)用液（ml）00.20.40.60.81.0磷酸鹽緩沖液（ml）21.81.61.41.21.0乙酰膽堿含量（μmol）01.42.84.25.67.0（2）各管加堿性羥胺4ml，立即振搖2min（3）各管加1∶2鹽酸溶液2ml，振搖2min（4）各管加10%三氯化鐵溶液2ml，搖勻，過濾（5）測吸光度:λ=520nm，參比管-第1管（6）繪制標準曲線2.樣品測定A管（樣品管）B管（對照管）0.98ml磷酸緩沖液0.98ml磷酸緩沖液20μl血20μl血37℃水浴5min堿性羥胺4ml,振3min乙酰膽堿標準應(yīng)用液1ml乙酰膽堿標準應(yīng)用液1ml37℃水浴30min（準確計時）堿性羥胺4ml,振3min1∶2鹽酸溶液2ml,搖1min10%三氯化鐵溶液2ml搖勻、過濾、比色計算1.被水解的乙酰膽堿吸光度=

對照管吸光度（B管）－樣品管吸光度（A管）2.對照標準曲線，得出被水解的乙酰膽堿(μmol)---即0.02ml血經(jīng)37℃，30min反應(yīng)條件下的

膽堿酯酶活性絕對值C3.膽堿酯酶活性相對值（%）浙江地區(qū)健康人膽堿酯酶活性絕對值男：3.22±0.336μmol女：3.19±0.398μmol注意事項采血前先準備好試管，加入磷緩采血時嚴格消毒，用過的棉球、刺針集中放置準確控制