食品安全的快速檢測-食品微生物快速檢測

阪崎腸桿菌熒光PCR檢測阪崎腸桿菌的介紹一熒光PCR檢測技術的介紹二阪崎腸桿菌熒光PCR檢測三目錄介紹阪崎腸桿菌阪崎腸桿菌是寄生在人和動物腸道內的革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬，周生鞭毛，能運動，以前一直被稱為“陰溝腸桿菌”?；谒c陰溝腸桿菌在生化反應、色素產物和抗菌靈敏度上存在差異，所以于1980年更名為阪崎腸桿菌。

阪崎腸桿菌可導致嬰兒及早產兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結腸炎，死亡率高達50％，已引起世界多國相關部門的重視。國家食源性疾病監(jiān)測網自2007年起把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方食品重點監(jiān)測病原菌。

介紹阪崎腸桿菌

阪崎腸桿菌具有產生a-葡萄糖苷酶和吐溫80脂酶、不發(fā)酵三梨醇以及無磷酸胺酶活性等生理生化特征，并且對干燥、滲透壓和抗生素等有很強的抗性。該菌自然來源非常廣泛，在水、土壤、植物根莖、動物腸道甚至加工食品中都可存在。

介紹PCR檢測技術基于a-葡萄糖苷酶反應的特異性生化檢測和PCR擴增的分子檢測技術已取得重要進展，但是目前還缺乏一種穩(wěn)定檢測該菌的分子分型檢測技術。近年來，被公認為診斷標準的新型實時定量PCR擴增熒光檢測技術和儀器實時熒光定量PCR儀可以實現阪崎腸桿菌的分子分型定量檢測。PCR檢測法的分類及優(yōu)點PCR檢測技術熒光法電泳法ELISA法靈敏度高特異性強抗污染能力強容易操作PCR技術的發(fā)展熒光PCR法PCR的發(fā)展可分為3階段：定性PCR（電泳法）酶免法定量PCR實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR技術的優(yōu)點熒光PCR法重復性、穩(wěn)定性好濃度梯度試驗線性范圍寬熱循環(huán)熱降溫快速熒光定量在對數期進行定量分析標本取樣阪崎腸桿菌熒光PCR檢測法取樣前消毒樣品包裝的開啟處和取樣工具。按照“三管”增菌法，無菌稱取100g、10g和1g樣品各三份分別加入2L、250mL、125mL的樣品稀釋瓶中，加入9倍預熱到45℃的滅菌水（1:10稀釋），或者將樣品直接稱量到裝有9倍預熱的45℃滅菌水的樣品稀釋瓶中振蕩使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18~22h分別移取培養(yǎng)18~22h的懸液各10mL加入90mL腸桿菌增菌肉湯（EE肉湯）中，36℃±1℃培養(yǎng)18~22h檢測步驟（1）試劑制備取出反應管N支（N=樣本數＋1管陽性對照＋1管陰性對照），快速離心后，存于4℃?zhèn)溆谩＃?）DNA提取標本處理：每瓶培養(yǎng)的EE肉湯分別取1mL加到1.5mL無菌離心管中，8000r/min離心5min，盡量吸取去除上清液；加入50μLDNA提取液（使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸取），混勻后沸水浴10min,12000r/min離心5min，取上清液2μL做模板進行PCR反應。（3）PCR擴增取出備用的PCR反應管，分別加入處理后的樣品上清2μL，陰陽性對照直接加2μL,瞬時離心后放人儀器樣品槽進行PCR反應。食品快速檢測技術分類試驗有效性判定設定閾值線高于陰性對照最高點，陽性對照的Ct值≤25.0，反應有效。食品快速檢測技術分類結果判定食品快速檢測技術分類設定閾值線高于陰性對照最高點，檢驗樣本Ct值小于或等于25.0時，報告阪崎腸桿菌篩選陽性；檢驗樣本Ct值大于25.0且小于30.0時，重復一次，如果Ct值仍小于30.0,且曲線有明顯的對數增長期，可報告阪崎腸桿菌篩選陽性，否則報告阪崎腸桿菌未檢出；樣本檢驗不到Ct值，或Ct值為0時，報告阪崎腸桿菌未檢出。金黃色葡萄球菌的快速檢測金黃色葡萄球菌介紹一金黃色葡萄球菌檢測方法二金黃色葡萄球菌的快速檢測三目錄介紹金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱“金葡菌”，隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌代表，為一種常見的食源性致病微生物。該菌最適宜生長溫度為37℃，pH為7.4，耐高鹽，可在鹽濃度接近10%的環(huán)境中生長。金黃色葡萄球菌常寄生于人和動物的皮膚、鼻腔、咽喉、腸胃、癰、化膿瘡口中，空氣、污水等環(huán)境中也無處不在。

介紹金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌能產生多種致病性物質，如腸毒素及凝固酶等。金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是一個全球性公共衛(wèi)生問題，據美國疾病預防控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，居第2位，占細菌性食物中毒的33％，加拿大的發(fā)生率更高，占細菌性食物中毒的45％。限量標準金黃色葡萄球菌

我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，國家衛(wèi)生和計劃生育委員會于2013年發(fā)布《食品安全國家標準食品中致病菌限量》(GB29921-2013)，在國標中制定了金黃色葡萄球菌的限量標準，規(guī)定熟肉制品、熟制水產品、熟制糧食制品等8大類食品中，同批次采集5份樣品，每份樣品中的金黃色葡萄球菌濃度均不得超出1000CFU/g，僅允許其中1份樣品在100~1000CFU/g之間。檢測方法金黃色葡萄球菌檢測方法目前，金葡菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)生化鑒定方法、免疫學、分子生物學快速檢測方法等。傳統(tǒng)生化鑒定方法操作簡單，穩(wěn)定性強，成本低，是目前最常用的鑒定方法。方法金黃色葡萄球菌檢測方法免疫學檢測方法主要是基于免疫學理論研究，其是通過設計的抗原、抗體和免疫細胞，檢測抗原和抗體的結合以及免疫細胞分泌的細胞因子的，從而達到檢測目的一種實驗方法。該技術方法主要包括酶聯免疫法、免疫熒光法、免疫膠體金法等

方法金黃色葡萄球菌檢測方法方法金黃色葡萄球菌檢測方法分子生物學檢測方法主要包括聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術，核酸探針技術，環(huán)介導等溫擴增技術等技術。方法金黃色葡萄球菌檢測方法試劑盒法：試劑盒法通常將十多種，甚至幾十種培養(yǎng)基或成分集中在特定微型裝置內，通過觀察微生物的生長和代謝過程的某些產物或現象，對試驗現象進行分析，將傳統(tǒng)試驗中多次試驗通過一次完成，縮短了檢測時間。此法可大大縮短測試時間，在24h內得出結果，甚至某些可縮短至4h內。目前，用于檢測金黃色葡萄球菌的成品試劑盒有API、MIS等

測試片的原理金黃色葡萄球菌測試片本試驗利用金黃色葡萄球菌自身生化特性優(yōu)化培養(yǎng)基，通過代謝而產生特異性酶或其他特異性物質，在培養(yǎng)基中添加相應的顯色底物，使菌落呈現特定的顏色實現分離和鑒別。通過無紡布、冷凝膠、塑料薄膜等作為培養(yǎng)基的載體，將以上材料組裝成金黃色葡萄球菌的測試片，縮短了檢測時間、降低了勞動強度、節(jié)約成本。檢測原理金黃色葡萄球菌測試片金黃色葡萄球菌測試片（FilmplateTMStaphylococcusaureusBT206)含有選擇性培養(yǎng)基和專一性的酶顯色劑，運用微生物測試片專有技術，做成一次性快速檢驗產品，一步培養(yǎng)15~24h就可確認是否有病原菌的存在，大大地簡化了檢測程序。金黃色葡萄球菌測試片適用范圍金黃色葡萄球菌的快速檢測本產品適用于各類生、熟食制品，飲料，糕點類，調味品，乳制品等的快速檢測。樣品處理金黃色葡萄球菌的快速檢測取樣品25mL(g)放入含有225mL滅菌磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的取樣罐或均質杯內，制成1:10的樣品勻液，調節(jié)樣品勻液pH至6.0~8.0。用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL稀釋液的試管內，振搖后成為1:100的樣品勻液，以此類推，每次換一支吸管。接種一般食品選2~3個稀釋度進行檢測，將金黃色葡萄球菌測試片（BT206)置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用無菌吸管吸取1mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右，使培養(yǎng)基凝固，每個稀釋度接種兩片。做一片空白陰性對照。金黃色葡萄球菌的快速檢測培養(yǎng)將測試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒溫培養(yǎng)箱內，堆疊片數不超過12片。培養(yǎng)溫度為36℃±1℃,培養(yǎng)15~24h。金黃色葡萄球菌的快速檢測培養(yǎng)后測試片現象測試片上紫紅色的菌落為金黃色葡萄球菌；呈藍色的菌落為其他大腸菌群。

出現陽性菌落的樣本，最好用其他更為可靠的方法進行驗證，沒有條件的至少要再取樣重復檢驗一次。金黃色葡萄球菌的快速檢測結果判讀（1）選擇菌落數在20~200個之間的紙片進行計數。（2）若兩個稀釋度的菌落數均在20~200之間，則取其平均菌落數乘以稀釋倍數，即為每毫升（或每克）樣品中金黃色葡萄球菌數。（3）如果所有稀釋度的測試片上的菌落數都小于20,則計數稀釋度最低的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之；如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數報告之。金黃色葡萄球菌的快速檢測結果判讀

（4）如果所有稀釋度的菌落數都大于200，計數最高稀釋度的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。計數菌落數大于200的測試片時，也可計數一個或兩個具有代表性的方格內的菌落數，換算成單個方格內的菌落數后乘以20(濾紙區(qū)面積為20cm2)，即為測試片上估算的菌落數。報告單位以CFU/mL(或CFU/g)表示。金黃色葡萄球菌的快速檢測優(yōu)點省去了配制培養(yǎng)基、分裝滅菌等前處理和試驗后清洗玻璃器皿等一系列繁雜的準備和整理工作，能大幅度減少工作量；攜帶方便，檢測成本較低；操作簡便迅速，對操作人員和檢驗設備及場所的要求也不高，可在基層檢驗機構或食品生產企業(yè)進行推廣應用。金黃色葡萄球菌的快速檢測沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）檢測背景01實驗方法及原理02樣品處理與測定步驟03應用范圍及結果分析04檢測背景檢測背景沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據統(tǒng)計在世界各國的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。：）沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）@_@實驗方法及原理實驗方法及原理酶聯免疫吸附法01該技術具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可以在短時間內準確地將有害微生物檢測出來。沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）實驗方法及原理實驗試劑02固相的抗原或抗體1酶標抗體或抗原2顯色劑3沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）實驗方法及原理實驗原理03@_@沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）樣品處理與測定步驟樣品處理與測定步驟樣品處理01待測樣品勻液的制備與稀釋:)沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）樣品處理與測定步驟測定步驟02加酶標抗體于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定后的稀釋度)0.1mL,37℃孵育0.5～1h,洗滌。2:)加一定稀釋的待測樣品0.1mL于已包被異性抗體反應孔中，置37℃孵育1h，然后洗滌，同時做空白孔、陰性對照及陽性對照孔。1:)加底物液顯色于各反應孔中，加入臨時配制的底物溶液0.1mL,37℃孵育10～30min。3:)沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）樣品處理與測定步驟測定步驟02結果測定置于酶標儀上測定各孔的OD值，并記錄結果，讀數在加終止液10min內完成。5:)終止反應于各反應孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。4:)沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）樣品處理與測定步驟測定步驟02@_@沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）適用范圍及結果分析適用范圍及結果分析應用范圍01所有食品原料中的沙門氏菌檢測:)沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）適用范圍及結果分析結果分析02臨界值(CO，cutoff)的計算:臨界值=陰性對照孔OD均值×2.1。1:)沙門氏菌的快速檢測（酶聯免疫吸附法）陰性對照孔OD(opticaldensity)均值大于0.1時重新實驗，小于0.05時以0.05計