雞胚成纖維細(xì)胞制備

關(guān)于雞胚成纖維細(xì)胞制備學(xué)習(xí)和掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備和培養(yǎng)方法；了解原代細(xì)胞培養(yǎng)的原理和方法。實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月CEF的培養(yǎng)是在一定條件下，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使從體內(nèi)取出的成纖維組織細(xì)胞生存、生長(zhǎng)和傳代，并維持原有組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特性。雞胚成纖維細(xì)胞元代培養(yǎng)第3頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月病毒能在易感的組織或單層細(xì)胞內(nèi)增殖，并可產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此，細(xì)胞培養(yǎng)是病毒學(xué)研究的重要手段，是進(jìn)行病毒性疫苗生產(chǎn)和病毒性疾病診斷必不可少的工具。原代細(xì)胞培養(yǎng)是體外制備細(xì)胞培養(yǎng)物的必經(jīng)過(guò)程，從供體體內(nèi)取出組織分散成單個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)液中為初次培養(yǎng)，從初次培養(yǎng)到第一次傳代培養(yǎng)為原代培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)以雞胚成纖維細(xì)胞作為原代細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐操作，認(rèn)識(shí)和體會(huì)原代細(xì)胞的制備方法和影響細(xì)胞培養(yǎng)的主要因素，并掌握原代細(xì)胞培養(yǎng)的方法。實(shí)驗(yàn)原理第4頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月超凈工作臺(tái)，檢卵燈，滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、眼科剪、眼科鑷、平皿、吸管、離心管等；9-11日齡雞胚；PBS，0.25%胰酶消化液，DMEM營(yíng)養(yǎng)液，75%酒精棉。實(shí)驗(yàn)所需器材、試劑第5頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（一）操作前的準(zhǔn)備1、預(yù)熱培養(yǎng)液：把已經(jīng)配制好的生長(zhǎng)液、Hanks液和胰蛋白酶液放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱；2、用75%酒精棉擦拭雙手和紫外線照射過(guò)的超凈工作臺(tái)；3、正確擺放要使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染；4、點(diǎn)燃酒精燈.5、準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的培養(yǎng)瓶。6、取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)步驟第6頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（二）雞胚成纖維細(xì)胞的制備1、雞胚的處理（1）蛋殼消毒取9-11日齡的雞胚，用檢卵燈選取血管清楚、活動(dòng)正常的雞胚，置蛋架上，令氣室端向上，用碘酒棉消毒蛋殼氣室部位。（2）胚體采集以鑷子擊破卵殼氣室部位，并除去該部位卵殼。用無(wú)菌的眼科鑷子撕開蛋殼氣室膜并小心撥開絨毛尿囊膜和羊膜，用彎鑷子夾住雞胚頸部，移入滅菌的平皿內(nèi)。用剪刀剪去胚頭、四肢及內(nèi)臟，用PBS洗去體表血液，移入滅菌小燒杯中。實(shí)驗(yàn)步驟第7頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（3）胚體勻漿用滅菌剪將胚體剪碎至1mm3小碎塊。加入PBS（淹住組織碎塊即可），輕搖，靜置1-2min，待組織塊下沉，吸去上層懸液。重復(fù)2-3次（以除去其中的紅細(xì)胞），至上懸液不混濁為止，移入滅菌的錐形瓶中，吸去PBS。實(shí)驗(yàn)步驟第8頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月2、分散細(xì)胞（1）胰酶消化將剪碎的組織塊放入錐形瓶中，加入適量的胰酶。包緊瓶口，37℃水域消化30min，每隔5min輕輕搖動(dòng)1次。當(dāng)組織塊變得蓬松透明時(shí)，吸棄消化液，用PBS洗兩遍，中止消化。如再繼續(xù)消化，可破壞細(xì)胞膜而不易貼壁生長(zhǎng)，如果消化不夠，則細(xì)胞不易分散。實(shí)驗(yàn)步驟第9頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（2）分散細(xì)胞將消化好的細(xì)胞懸液從水浴鍋中取出，棄去上層液體，加5mL含血清的DMEM生長(zhǎng)液（DMEM營(yíng)養(yǎng)液+5%犢牛血清+100IU/ml青鏈霉素，用7.5%NaHCO3溶液調(diào)pH7.2），以吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，此時(shí)可見生長(zhǎng)液混濁，即為細(xì)胞懸液。靜置1min后，使未沖散的組織塊下沉。（3）過(guò)濾用4層脫脂紗布將吹打后的細(xì)胞過(guò)濾到平皿中，收集濾液。實(shí)驗(yàn)步驟第10頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（三）分裝與培養(yǎng)1、細(xì)胞計(jì)數(shù)用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，加入DMEM生長(zhǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度至50萬(wàn)-60萬(wàn)個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)步驟第11頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月2、分裝與培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入2mLDMEM生長(zhǎng)液(如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加4mL生長(zhǎng)液)，小心吸出過(guò)濾后的細(xì)胞懸液0.25mL至培養(yǎng)瓶中（如果是50mL的培養(yǎng)瓶，加0.5mL的細(xì)胞懸液)，吹打均勻蓋好瓶塞。在瓶上注明組別、日期，置37℃溫箱中培養(yǎng)(4h后細(xì)胞即可貼壁，24-36h生長(zhǎng)成單層細(xì)胞，此時(shí)可更換培養(yǎng)液，并接種病毒)。分裝后2-4h不可大幅度移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以免影響細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)步驟第12頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月（四）細(xì)胞形態(tài)觀察檢查時(shí)注意培養(yǎng)液的顏色變化，變黃但不混濁表示有細(xì)胞生長(zhǎng)，變紅表示細(xì)胞未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不佳。37℃培養(yǎng)24-48h后，于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞可以長(zhǎng)成單層，細(xì)胞透亮，呈纖維狀，細(xì)胞膜清晰。實(shí)驗(yàn)步驟第13頁(yè),共15頁(yè)，星期六，2024年，5月五、注意事項(xiàng)1、整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作2、培養(yǎng)液不要太多，應(yīng)有足夠的空間保證細(xì)胞對(duì)氧的需要3、放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)，將CO2濃度控制在5%。4、吸除消化液，向瓶?jī)?nèi)注入PBS數(shù)毫升，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意沖洗細(xì)胞時(shí)，動(dòng)作要輕，以免把已松動(dòng)的細(xì)胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液?jiǎn)为?dú)消化，吸除胰酶液后，可不用PBS沖洗，直接加入培養(yǎng)液。5、細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)玻璃器皿洗滌要求嚴(yán)格，徹底洗滌后用蒸餾水沖洗，再用雙蒸水沖