飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)定-編制說(shuō)明

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

《飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶

和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)定》

編制說(shuō)明

（公開(kāi)征求意見(jiàn)稿）

四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司

山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心

2023年5月

1

一、工作簡(jiǎn)況

1.1任務(wù)來(lái)源

根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2020年第三批推薦性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

計(jì)劃的通知》（國(guó)標(biāo)委發(fā)[2020]48號(hào)），本標(biāo)準(zhǔn)修訂項(xiàng)目編號(hào)為

20203890-T-469，項(xiàng)目名稱為《飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和

二甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)定》，項(xiàng)目承擔(dān)單位為四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有

限公司、山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所、通威股份有限公司。2021年3月，《中

共山東省委機(jī)構(gòu)編制委員會(huì)辦公室關(guān)于印發(fā)省畜牧獸醫(yī)局所屬事業(yè)單位機(jī)

構(gòu)職能編制規(guī)定的通知》（魯編辦[2021]69號(hào)），整合山東省飼料質(zhì)量檢

驗(yàn)所畜牧環(huán)境監(jiān)測(cè)職責(zé)、山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所畜產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)職責(zé)，組

建山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，撤銷山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所和山東省獸藥

質(zhì)量檢驗(yàn)所事業(yè)單位建制。因通威股份有限公司內(nèi)部組織構(gòu)架變革，對(duì)公

司板塊業(yè)務(wù)進(jìn)行細(xì)分，新成立通威農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，承擔(dān)原通威股份有

限公司農(nóng)牧板塊全部業(yè)務(wù)，計(jì)劃未來(lái)單獨(dú)拆分上市，使后續(xù)業(yè)務(wù)更聚焦。

因此，主要起草單位現(xiàn)變更為四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司、山東省畜

產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、通威農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)修訂背景

磺胺類藥物是一類以對(duì)氨基苯磺酰胺為基本結(jié)構(gòu)的衍生物，對(duì)革蘭氏

陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑制作用。磺胺類藥物具有抗菌譜廣、性質(zhì)

穩(wěn)定、產(chǎn)量大、品種多、使用便利、供應(yīng)充足、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛

的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)中。隨著學(xué)者對(duì)磺胺類的藥動(dòng)學(xué)深入研究發(fā)現(xiàn)，磺

胺類藥物在抗菌方面起到巨大作用的同時(shí)，不良反應(yīng)、藥物殘留問(wèn)題、病

1

原體耐藥問(wèn)題等缺點(diǎn)也極大的限制了磺胺類藥物的應(yīng)用和發(fā)展。為了解決

上述問(wèn)題，人們采用磺胺增效劑與磺胺類藥物聯(lián)合使用的方法，在增強(qiáng)了

磺胺類藥物效果的同時(shí)降低了磺胺類藥物的用藥量，使藥物副作用降低、

動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留減少、具有耐藥性的病原體出現(xiàn)機(jī)率大大降低。

磺胺增效劑是人工合成的二氨基嘧啶類藥物，自1969年發(fā)現(xiàn)了三甲氧

芐氨嘧啶后，磺胺增效劑便受到了廣泛的應(yīng)用。在我國(guó)常用的有二甲氧芐

氨嘧啶（Diaveridine，DVD）、三甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP）及

二甲氧甲基芐氨嘧啶（Ormetoprim，OMP）。磺胺增效劑本身具有較弱的

抗菌作用，與磺胺類藥物聯(lián)用具有協(xié)同作用，能數(shù)倍甚至數(shù)十倍增強(qiáng)磺胺

類藥物的療效。不僅增強(qiáng)了磺胺類藥物的抗菌譜和抗菌性，甚至可以將磺

胺類藥物的抑菌作用轉(zhuǎn)變成殺菌作用，廣泛用于畜禽細(xì)菌性疾病和球蟲病

的治療。對(duì)磺胺藥敏感的細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，不能直接從生長(zhǎng)環(huán)境中

利用外源性葉酸，而是利用對(duì)氨基苯甲酸、碟啶和谷氨酸，在二氫葉酸合

成酶的催化下合成二氫葉酸，再由二氫葉酸還原酶的催化，還原成四氫葉

酸。四氫葉酸是一碳基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶的輔酶，參與嘌呤、嘧啶、核苷酸的生物

合成，如果細(xì)菌缺乏四氫葉酸，則核酸的合成就會(huì)受到阻礙，其生長(zhǎng)繁殖

就會(huì)受到抑制。DVD、TMP及OMP的抗菌機(jī)理相似，均可逆性抑制二氫

葉酸還原酶，使二氫葉酸不能還原為四氫葉酸，干擾葉酸的代謝和利用，

從而妨礙菌體核酸和蛋白質(zhì)的合成。磺胺類藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與對(duì)氨基苯甲

酸結(jié)構(gòu)極為相似，能和對(duì)氨基苯甲酸相互競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，從而抑制

二氫葉酸的合成，最終使核酸合成受阻，抑制細(xì)菌的繁殖。DVD、TMP及

OMP與磺胺類藥物聯(lián)用時(shí)，可同時(shí)從葉酸代謝前后兩個(gè)不同環(huán)節(jié)起雙重阻

2

斷作用，展現(xiàn)出協(xié)同作用，使磺胺藥抗菌活性增強(qiáng)數(shù)倍至數(shù)十倍，可使抑

菌作用變?yōu)闅⒕饔?，減少耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌及球

蟲等均有殺滅作用，并能擴(kuò)大磺胺藥的抗菌范圍，對(duì)耐磺胺藥的大腸桿菌、

變形桿菌、化膿鏈球菌等亦有作用。近年來(lái)研究表明，DVD和TMP也能

抑制蟲體葉酸代謝，干擾蟲體蛋白質(zhì)的合成，故對(duì)一些寄生蟲病也有很好

的防治效果。隨著對(duì)磺胺增效劑深入研究發(fā)現(xiàn)，磺胺增效劑不僅能增強(qiáng)磺

胺類藥物的抗菌效果，而且也能增強(qiáng)其他多種抗生素的療效，如對(duì)四環(huán)素

抗流感桿菌、抗肺炎雙球菌的作用可增強(qiáng)4~46倍、對(duì)慶大霉素抗流感桿菌、

抗肺炎雙球菌的作用可增強(qiáng)4~8倍。

目前食品安全問(wèn)題已成為消費(fèi)者重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，也是畜牧業(yè)、食品

業(yè)研究的熱點(diǎn)之一。但養(yǎng)殖中常存在不合理使用藥物的情況、且其在動(dòng)物

體內(nèi)代謝緩慢、殘留在肌肉組織和器官中時(shí)間較長(zhǎng)，并可通過(guò)食物鏈傳遞，

人食用后會(huì)導(dǎo)致抗藥性甚至毒副作用。飼料作為畜禽食物鏈的第一關(guān)鍵環(huán)

節(jié)，其質(zhì)量關(guān)系到畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全和人體的健康，人們長(zhǎng)期食用含有

抗菌增效劑殘留物的畜禽產(chǎn)品會(huì)造成對(duì)泌尿、神經(jīng)等不良反應(yīng)，因此必須

從飼料源頭上嚴(yán)格控制該藥物的使用。

我國(guó)于2007年發(fā)布實(shí)施的《飼料中三甲氧芐氨嘧啶的測(cè)定高效液相

色譜法》（GB/T21037-2007）標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)在企業(yè)和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)日常檢測(cè)，

農(nóng)業(yè)部和地方監(jiān)督抽查、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和預(yù)警監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用。但該方

法實(shí)施已十多年，亟需對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，一是由于該方法靈敏度較低，

對(duì)于痕量檢測(cè)常常低于噪聲基線，并且無(wú)法準(zhǔn)確定性，特別是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部

公告194號(hào)明確提出，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有

3

促生長(zhǎng)類藥物添加劑飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料，亟需根據(jù)當(dāng)

前我國(guó)飼料行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，開(kāi)展方法學(xué)研究，研究建立簡(jiǎn)便、快速、靈敏

度高、定性準(zhǔn)確的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法，滿足飼料禁抗需要；二是

農(nóng)業(yè)部2349號(hào)公告-8-2015《飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二

甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》與本標(biāo)準(zhǔn)有交叉重復(fù)，

建議將同種類的二甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶并入本國(guó)標(biāo)，修訂

成為可對(duì)3種增效劑既能準(zhǔn)確定性又能準(zhǔn)確定量標(biāo)準(zhǔn)方法，提高標(biāo)準(zhǔn)的適

用性。

1.3工作過(guò)程

1.3.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組

2020年11月，四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司、山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)

所、通威股份有限公司接到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂任務(wù)后，成立了標(biāo)準(zhǔn)編制小組，

落實(shí)了人員分工，詳見(jiàn)表1。

表1標(biāo)準(zhǔn)主要起草人員和任務(wù)分工

人員職稱任務(wù)分工

張鳳枰教授級(jí)高工項(xiàng)目主持人，負(fù)責(zé)項(xiàng)目的全面工作

王鑫工程師檢測(cè)方法研究，標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明編寫和完善、方法驗(yàn)證

李俊玲研究員實(shí)施方案制定，標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明編寫和完善、征求意見(jiàn)

唐華英助理工程師樣品檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集分析

孫延軍副研究員樣品采集、數(shù)據(jù)收集分析

杜雪莉高級(jí)工程師標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明編寫和完善、征求意見(jiàn)

楊發(fā)樹(shù)高級(jí)工程師樣品采集、標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明編寫和完善

張璐研究員標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明編寫和完善

4

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)修訂技術(shù)路線和方案制定

2020年12月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組查閱了國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)資料，同時(shí)

調(diào)研國(guó)內(nèi)主要飼料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、飼料生產(chǎn)企業(yè)等標(biāo)準(zhǔn)方法采用情況，制定了

標(biāo)準(zhǔn)修訂內(nèi)容和技術(shù)路線草案，確定標(biāo)準(zhǔn)修訂的主要內(nèi)容、技術(shù)路線（見(jiàn)

圖1）、分工、完成時(shí)限等。

方法適用范圍修訂

HPLC、LC-MS/MS方法研究、方法比較

方法學(xué)考察、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

樣品收集、方法適用性考察

方法驗(yàn)證

形成標(biāo)準(zhǔn)征求意見(jiàn)稿和編制說(shuō)明

面向全行業(yè)征求專家和同行意見(jiàn)

標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)審、終審和報(bào)批

圖1標(biāo)準(zhǔn)修訂技術(shù)路線圖

1.3.3樣品收集、方法學(xué)研究和實(shí)際樣品檢測(cè)

2021年1月~2022年7月，開(kāi)展樣品收集、方法學(xué)研究和實(shí)際樣品檢

測(cè)。

1.3.4編寫編制說(shuō)明和征求意見(jiàn)稿、定向征求意見(jiàn)和標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證

2022年9月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組完成標(biāo)準(zhǔn)文本、編制說(shuō)明定向征求意見(jiàn)稿

5

編制工作。2022年10月~11月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組發(fā)送給國(guó)家飼料質(zhì)檢中心、

省部級(jí)飼料質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、大中型飼料企業(yè)實(shí)驗(yàn)室、全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)

委員會(huì)委員等相關(guān)的質(zhì)檢機(jī)構(gòu)、科研院所、高校、企業(yè)等單位的專家征求

意見(jiàn)。

2022年12月~2023年3月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組根據(jù)定向征求意見(jiàn)，補(bǔ)充了

相關(guān)試驗(yàn)和數(shù)據(jù)，修改、完善標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明，委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料

及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心（成都）、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢

驗(yàn)測(cè)試中心（南昌）和青島市華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司完成本標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)核驗(yàn)

證工作，2023年4月形成標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說(shuō)明預(yù)審稿。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)預(yù)審

2023年5月8日，全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)飼料檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)

化工作組組織專家對(duì)四川威爾檢測(cè)技術(shù)股份有限公司等單位修訂的國(guó)家標(biāo)

準(zhǔn)《飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)

定》（預(yù)審稿）進(jìn)行了認(rèn)真審查。專家組由常碧影、柏凡、楊秀玉、曹瑩、

任玉琴、宋榮、吳銀良、李宏、岳秀英、吳寧鵬、楊青組成。在聽(tīng)取修訂

專家匯報(bào)的基礎(chǔ)上，專家組審查了標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說(shuō)明，提出如下修改意

見(jiàn)：

（1）建議將適用范圍中“飼料原料”修改為“動(dòng)物源性飼料原料”。

（2）進(jìn)一步考察液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法定量的差異，

并根據(jù)補(bǔ)充試驗(yàn)數(shù)據(jù)決定是否采用內(nèi)標(biāo)法定量。

（3）根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜

法的精密度要求。

6

（4）編制說(shuō)明中補(bǔ)充與原標(biāo)準(zhǔn)GB/T21037－2007數(shù)據(jù)比較。

（5）按照GB/T1.1－2020、GB/T20001.4－2015的要求規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)文

本及編制說(shuō)明。

與會(huì)專家一致同意標(biāo)準(zhǔn)起草單位按照上述意見(jiàn)修改形成征求意見(jiàn)稿，

報(bào)全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)秘書處。

7

二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)

2.1標(biāo)準(zhǔn)編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)、技術(shù)要素及表述方法是按照GB/T1.1－2020《標(biāo)準(zhǔn)化

工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》以及GB/T20001.4

－2015《標(biāo)準(zhǔn)編制規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定和要求進(jìn)行編寫。

編制依據(jù)如下：

（1）遵循國(guó)家頒布的相關(guān)法律法規(guī)；

（2）有關(guān)國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；

（3）國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻(xiàn)；

（4）標(biāo)準(zhǔn)編制小組調(diào)研和實(shí)測(cè)的樣品檢測(cè)數(shù)據(jù)。

標(biāo)準(zhǔn)修訂結(jié)合國(guó)內(nèi)外檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)和我國(guó)飼料行業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀，力

求做到技術(shù)上先進(jìn)、經(jīng)濟(jì)上合理，確保標(biāo)準(zhǔn)方法的準(zhǔn)確性、可靠性和通用

性。

2.2標(biāo)準(zhǔn)修訂主要內(nèi)容

經(jīng)查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧

甲基芐氨嘧啶殘留的提取溶劑主要包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷

等色譜領(lǐng)域常見(jiàn)的有機(jī)試劑，凈化方法主要包括液液萃取法、固相萃取法、

QuEChERS快速提取凈化法等，檢測(cè)儀器主要為分光光度儀、高效液相色

譜儀、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀等。因二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶

和二甲氧甲基芐氨嘧啶禁止在飼料產(chǎn)品中使用，本次修訂主要增加液相色

譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法，修訂高效液相色譜法，主要從樣品提取、凈化和測(cè)

定三方面開(kāi)展標(biāo)準(zhǔn)方法研究工作，對(duì)具體試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，開(kāi)展方法學(xué)

8

考察和適用性考察，確保修訂后的標(biāo)準(zhǔn)方法定性定量分析準(zhǔn)確可靠。

2.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

2.3.1儀器分析條件確定

2.3.1.1色譜條件的選擇

由于二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶均為極

性化合物，本方法采用實(shí)驗(yàn)室反相色譜中最常用的C18色譜柱進(jìn)行分析。試

驗(yàn)分別選用柱長(zhǎng)100mm、內(nèi)徑2.1mm、粒徑1.8μm和柱長(zhǎng)50mm、內(nèi)徑

2.1mm、粒徑1.8μm的2種最為常見(jiàn)的超高效液相色譜柱進(jìn)行考察。在三

種目標(biāo)化合物分離度滿足試驗(yàn)要求的前提下，為降低檢測(cè)成本、減輕長(zhǎng)柱

壓力高對(duì)儀器的損傷，最終確定柱長(zhǎng)50mm、內(nèi)徑2.1mm、粒徑1.8μm超

高效液相色譜柱為分析柱。同時(shí)，本試驗(yàn)考察了三種目標(biāo)化合物在不同品

牌色譜柱上的色譜行為。結(jié)果表明，三種目標(biāo)化合物在不同品牌色譜柱上

均有很好的分離度。3種目標(biāo)化合物的總離子流圖見(jiàn)圖2~圖4。

二甲氧芐氨嘧

三甲氧芐氨嘧啶

二甲氧甲基芐氨嘧啶

圖2二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶總離子流圖

（AgilentC182.1mm*100mm，1.8μm）

9

二甲氧芐氨嘧啶

二甲氧甲基芐氨嘧啶

三甲氧芐氨嘧啶

圖3二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶總離子流圖

（AgilentC182.1mm*50mm，1.8μm）

二甲氧芐氨嘧啶

二甲氧甲基芐氨嘧啶

三甲氧芐氨嘧啶

圖4二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶總離子流圖

（WatersC182.1mm*100mm，1.9μm）

10

為了提高色譜分析效率，提高目標(biāo)化合物的靈敏度，本試驗(yàn)流動(dòng)相采

用洗脫能力較強(qiáng)的乙腈作為有機(jī)相，采用0.2%甲酸水溶液作為水相。為了

確保得到的色譜峰對(duì)稱性好，消除峰拖尾現(xiàn)象，本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法在0.2%甲

酸水溶液中加入2mmol/L乙酸銨，使流動(dòng)相形成緩沖體系，有利于檢測(cè)結(jié)

果的重現(xiàn)性。另外，選用梯度洗脫方式，在提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，能夠

將樣品中的絕大多數(shù)雜質(zhì)從色譜柱洗脫下來(lái)，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。本

標(biāo)準(zhǔn)方法研究試驗(yàn)使用Agilent1290-6470液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，該儀器購(gòu)

于2019年，儀器檢測(cè)靈敏度非常高，我們最終將進(jìn)樣量確定為3μL。在保

證儀器性能的前提下，為降低柱溫對(duì)色譜柱使用壽命的影響，本試驗(yàn)將柱

溫設(shè)定為35℃。

液相色譜參考條件如下：

a）色譜柱：C18柱，柱長(zhǎng)50mm，內(nèi)徑2.1mm，粒徑1.8μm，或性能

相當(dāng)者；

b）柱溫：35℃；

c）流速：0.3mL/min；

d）進(jìn)樣量：3L；

e）流動(dòng)相：A相為乙腈（4.2.4）；B相為乙酸銨-甲酸溶液（4.2.16），

梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

11

表2梯度洗脫程序

時(shí)間（min）A相（%）B相（%）

0.001585

2.001585

5.003070

5.101000

6.001000

6.101585

7.001585

2.3.1.2質(zhì)譜參考條件確定

由于儀器廠家不同，質(zhì)譜設(shè)置參數(shù)也不同。因此不同廠家和型號(hào)的液

相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀應(yīng)優(yōu)化關(guān)鍵參數(shù)，使其達(dá)到最佳靈敏度。本標(biāo)準(zhǔn)方法研

究試驗(yàn)使用Agilent1290-6470液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，經(jīng)各參數(shù)優(yōu)化后其條

件如下：

離子源：電噴霧離子源；

掃描方式：正離子掃描；

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；

毛細(xì)管電壓：4000V；

鞘氣溫度：350℃；

鞘氣流速：11L/min；

噴嘴電壓：45psi；

干燥氣溫度：300℃；

干燥氣流速：7L/min。

定性、定量離子對(duì)及碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表3。

12

表3二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶定性定量離子對(duì)及碰撞能量參考值

定性離子對(duì)定量離子對(duì)碰撞能量

被測(cè)物名稱

m/zm/zV

261.2＞245.030

二甲氧芐氨嘧啶261.2＞245.0

261.2＞123.325

291.3＞230.225

三甲氧芐氨嘧啶291.3＞230.2

291.3＞261.030

275.4＞259.330

二甲氧甲基芐氨嘧啶275.4＞259.3

275.4＞123.325

d9-三甲氧芐氨嘧啶300.2>234.0300.2>234.025

圖5~圖12分別是濃度為100ng/mL二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、

二甲氧甲基芐氨嘧啶和d9-三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

和二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5二甲氧芐氨嘧啶一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

13

圖6三甲氧芐氨嘧啶一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

圖7二甲氧甲基芐氨嘧啶一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

14

圖8d9-三甲氧甲基芐胺嘧啶一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖

圖9二甲氧芐氨嘧啶二級(jí)描質(zhì)譜圖

15

圖10三甲氧芐氨嘧啶二級(jí)描質(zhì)譜圖

圖11二甲氧甲基芐氨嘧啶二級(jí)描質(zhì)譜圖

16

圖12d9-三甲氧芐氨嘧啶二級(jí)描質(zhì)譜圖

2.3.2提取方法選擇

二甲氧芐氨嘧啶又名二甲氧芐啶、敵菌凈，化學(xué)名為2,4-二氨基

-5-(3’,4’-二甲氧基芐基)嘧啶，分子式為C13H16N4O2，分子量260.29，化學(xué)

結(jié)構(gòu)式如圖13所示。二甲氧芐氨嘧啶為白色或淡黃色結(jié)晶性粉末，味微苦，

幾乎無(wú)臭，熔點(diǎn)231℃~236℃，溶于濃鹽酸，微溶于稀鹽酸，極微溶于氯

仿，不溶于乙醇、乙醚、水、稀堿溶液。

圖13二甲氧芐氨嘧啶化學(xué)結(jié)構(gòu)式

三甲氧芐氨嘧啶又名甲氧芐氨嘧啶、甲氧芐啶，化學(xué)名為5-[(3,4,5-三

甲氧基苯基)-甲基]-2,4-嘧啶二胺，分子式為C14H18N4O3，分子量290.32，

17

化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖14所示。三甲氧芐氨嘧啶為白色或淡黃色結(jié)晶性粉末，味

微苦，熔點(diǎn)199℃~203℃，在乙醇中微溶，水中幾乎不溶，在冰醋酸中易

溶。

圖14三甲氧芐氨嘧啶化學(xué)結(jié)構(gòu)式

二甲氧甲基芐氨嘧啶又名奧美普林，化學(xué)名為5-(4,5-二甲氧基-2-甲基

芐基)-2,4-二氨嘧啶，分子式為C14H18N4O2，分子量為274.324?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)

如圖15所示。二甲氧甲基芐氨嘧啶為白色或淡黃色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)為

231℃~235℃。不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。

圖15二甲氧甲基芐氨嘧啶化學(xué)結(jié)構(gòu)式

從圖13~圖15可以看出，二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧

甲基芐氨嘧啶均屬于極性化合物。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，我們選取基質(zhì)較

為復(fù)雜的仔豬配合飼料2g，空白基質(zhì)加標(biāo)量約為250μg/kg，分別使用乙

腈、5%甲酸乙腈、5%氨水乙腈、甲醇、5%甲酸甲醇、5%氨水甲醇、二氯

甲烷、乙酸乙酯溶液作為溶劑進(jìn)行提取，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算其回收率，結(jié)果

見(jiàn)下表4。

18

表4仔豬配合飼料各種提取溶劑回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物甲酸氨水甲酸氨水

乙腈5%5%甲醇5%5%二氯甲烷乙酸乙酯

乙腈乙腈甲醇甲醇

二甲氧

1芐胺嘧啶43.7238.4136.1013.3714.0610.6961.9570.84

三甲氧

2芐氨嘧啶49.5742.1043.9326.3035.4218.3165.9775.84

二甲氧甲

3基芐氨嘧50.5765.6460.8538.0859.0334.5070.8881.61

啶

由表4中回收率結(jié)果可知，乙酸乙酯溶液回收率最高，乙酸乙酯綠色

環(huán)保、成本低廉，且其毒性低于甲醇、乙腈、二氯甲烷。因此本試驗(yàn)考慮

采用乙酸乙酯作為提取液。

另外，從圖13~圖15可以看出，二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和

二甲氧甲基芐氨嘧啶均屬于堿性化合物。為了提高目標(biāo)化合物的提取效率，

參考《GBT21037-2007飼料中三甲氧芐胺嘧啶的測(cè)定高效液相色譜法》

和《農(nóng)業(yè)部2349號(hào)公告-8-2015飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶

和二甲氧甲基芐氨嘧啶的測(cè)定液相色譜串-聯(lián)質(zhì)譜法》前處理方法，本實(shí)

驗(yàn)在提取過(guò)程加入弱堿性的乙酸鈉溶液在分散固體樣品基質(zhì)的同時(shí)抑制二

甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的電離，使目標(biāo)化

合物處于分子狀態(tài)?？紤]到本標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍廣，我們?cè)谝宜徕c溶液中加

入0.5mL氨水以確保發(fā)酵型等酸性樣品基質(zhì)的適用性，然后使用乙酸乙酯

作為提取試劑進(jìn)行液液萃取。

試驗(yàn)分別選用仔豬配合飼料、蛋雞濃縮飼料、肉牛精料補(bǔ)充料、畜禽

用復(fù)合預(yù)混合飼料各2g，添加成濃度約為250μg/kg，考察乙酸乙酯溶液

對(duì)其提取效率，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，仔豬配合飼料、蛋雞濃縮飼料、

肉牛精料補(bǔ)充料、畜禽用復(fù)合預(yù)混合飼料采用乙酸乙酯溶液提取效率較高，

19

因此最終選擇乙酸乙酯作為飼料中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二

甲氧甲基芐氨嘧啶的提取溶劑。

表5乙酸乙酯提取回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物肉牛精料畜禽用復(fù)合

仔豬配合飼料蛋雞濃縮飼料

補(bǔ)充料預(yù)混合飼料

1二甲氧芐氨嘧啶70.8168.5469.54104.58

2三甲氧芐氨嘧啶78.3479.0478.58105.04

3二甲氧甲基芐氨嘧啶82.6880.6181.1798.80

為了驗(yàn)證提取次數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，試驗(yàn)考察了采用20mL乙酸乙

酯溶液1次提取、10mL乙酸乙酯溶液2次提取回收率情況，結(jié)果表明，

提取溶液總體積一致的情況下，2次提取效率明顯高于1次提取效率，且2

次提取回收率較高。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6不同提取次數(shù)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

1次提取2次提取

1二甲氧芐氨嘧啶65.3284.81

2三甲氧芐氨嘧啶70.6488.55

3二甲氧甲基芐氨嘧啶76.2890.24

選擇2次提取，考察了提取液體積分別為10mL、20mL、30mL回收

率情況，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明，不同提取液體積，回收率無(wú)明顯增

加。當(dāng)提取液體積為10mL時(shí)，雖然回收率較高，但對(duì)于油脂含量較高的

樣品，離心后乳化情況嚴(yán)重，上清液較少，不利于轉(zhuǎn)移。提取體積為30mL

回收率與20mL接近，考慮試劑成本，最終選擇乙酸乙酯提取液總體積為

20mL、分2次提取。

20

表7不同提取液體積回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

10mL20mL30mL

1二甲氧芐氨嘧啶79.8784.3582.15

2三甲氧芐氨嘧啶83.5591.65102.68

3二甲氧甲基芐氨嘧啶89.3692.3591.32

為了進(jìn)一步考察提取時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，固定乙酸乙酯提取液體

積為20mL、2次提取，考察了每次提取時(shí)間分別為5min、10min、15min

時(shí)樣品回收率，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著提取時(shí)間增加，回收率無(wú)明顯增加。

為保證不同類型樣品的提取效率，且綜合考慮時(shí)間成本，最終將樣品分2

次提取、分次提取10min。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8不同提取時(shí)間回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

5min/次、提取2次10min/次、提取2次15min/次、提取2次

1二甲氧芐氨嘧啶100.53102.23103.58

2三甲氧芐氨嘧啶100.8699.39103.57

3二甲氧甲基芐氨嘧啶104.73104.14108.32

2.3.3樣品凈化條件選擇

飼料產(chǎn)品基質(zhì)非常復(fù)雜，除含有大量蛋白質(zhì)、脂肪、含氮浸出物外，

生產(chǎn)時(shí)為了保證動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的全面性，往往還會(huì)添加各類維生素、礦物質(zhì)、

氨基酸、酶制劑、微生態(tài)制劑等。如果不對(duì)樣品提取液加以凈化處理，試

樣提取溶液含有太多的雜質(zhì)，這將極大影響色譜分離效果，降低檢測(cè)結(jié)果

的準(zhǔn)確性、靈敏度，且對(duì)儀器產(chǎn)生極大的負(fù)荷，降低液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)

用儀使用壽命。因此試驗(yàn)中選擇適當(dāng)?shù)膬艋椒ㄊ鞘直匾摹?/p>

21

目前對(duì)于磺胺類及磺胺增效劑類藥物，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室主流凈化方法是

固相萃取技術(shù)。利用固相萃柱對(duì)待測(cè)物或樣品中雜質(zhì)選擇性吸收，從而達(dá)

到凈化的目的。本方法基于二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲

基芐氨嘧啶的理化性質(zhì)，參考相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，選用市面上常見(jiàn)的堿性氧

化鋁柱、中性氧化鋁柱、SCX小柱、HLB小柱和MCX小柱開(kāi)展凈化條件

的選擇和優(yōu)化。

選取空白仔豬配合飼料2g，添加濃度為250μg/kg二甲氧芐氨嘧啶、

三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙酸乙酯提取，分別

經(jīng)堿性氧化鋁柱、中性氧化鋁柱、SCX小柱、HLB小柱和MCX小柱凈化，

收集洗脫液，氮吹干后復(fù)溶，過(guò)0.22μm微孔濾膜后上機(jī)測(cè)定，計(jì)算其回

收率，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9不同固相萃取小柱回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

堿性氧化鋁柱中性氧化鋁柱SCX柱HLB柱MCX柱

二甲氧

1芐胺嘧啶47.28未檢出73.593.6075.19

三甲氧

2芐氨嘧啶50.10未檢出73.685.4574.75

二甲氧甲基

3芐氨嘧啶52.50未檢出78.026.0979.04

結(jié)果表明，中性氧化鋁柱不保留目標(biāo)化合物，HLB柱效果極差，堿性

氧化鋁柱效果較差，SCX柱和MCX柱凈化效果較好。MCX柱作為SCX

柱的升級(jí)版，在保留了SCX柱的凈化特點(diǎn)外，還具有反相保留作用，對(duì)堿

性化合物具有較高的選擇性和靈敏度。綜合考慮后，最終選擇MCX柱作

為凈化柱。該試驗(yàn)結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)采用的凈化方式結(jié)論一致?？紤]到

MCX柱的普及性和經(jīng)濟(jì)性，我們最終選取60mg/3mL規(guī)格的小柱進(jìn)行試

22

驗(yàn)，并對(duì)其淋洗、洗脫條件進(jìn)行摸索。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)比較，最終將凈化條件

確定為“將固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL乙腈-5%乙酸水溶液（10:90，

V/V）活化；移取全部復(fù)溶液過(guò)柱；用3mL乙腈-5%乙酸水溶液（10:90，

V/V）、3mL甲醇淋洗；用5mL8%氨水甲醇洗脫并收集洗脫液，于50℃

氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.0mL復(fù)溶液溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，過(guò)0.22μm微孔

濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2.3.4不同廠家固相萃取柱效果比較

為了考察不同廠家混合型強(qiáng)陽(yáng)離子固相萃取柱的通用性，稱取仔豬配

合飼料2g，添加濃度為250μg/kg二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二

甲氧甲基芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，考察3個(gè)不同廠家的MCX小柱凈化效果，

結(jié)果見(jiàn)表10。

表10不同廠家混合型陽(yáng)離子固相萃取柱回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

廠家1廠家2廠家3

1二甲氧芐氨嘧啶85.4990.1087.66

2三甲氧芐氨嘧啶83.7788.3685.24

3二甲氧甲基芐氨嘧啶87.7788.3585.98

結(jié)果表明，樣品提取液經(jīng)3個(gè)廠家MCX固相萃取小柱凈化后得到的

回收率和重現(xiàn)性普遍較好，說(shuō)明不同廠家的固相萃取柱對(duì)二甲氧芐氨嘧啶、

三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶的凈化效果差異不大，均適用于本

方法。

2.3.6固相萃取柱柱容量考察

本標(biāo)準(zhǔn)凈化方法中采用了規(guī)格為200mg/3mLMCX小柱。為了考察該

23

小柱的容量，防止出現(xiàn)目標(biāo)化合物過(guò)載情況，我們用空白基質(zhì)樣品添加高

濃度水平的二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶，按

上述提取方法和凈化方法處理后上HPLC測(cè)定?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表11~表13。

表11固相萃取柱容量考察結(jié)果（三甲氧芐氨嘧啶）

三甲氧芐氨嘧啶平均回收率（%）

樣品類型

500mg/kg800mg/kg1000mg/kg1500mg/kg2000mg/kg

配合飼料92.596.787.787.691.8

濃縮飼料101.497.289.790.488.7

精料補(bǔ)充料101.995.290.890.489.5

復(fù)合預(yù)混合飼料101.494.991.091.788.9

表12固相萃取柱容量考察結(jié)果（二甲氧甲基芐氨嘧啶）

二甲氧甲基芐氨嘧啶平均回收率（%）

樣品類型

500mg/kg800mg/kg1000mg/kg1500mg/kg2000mg/kg

配合飼料89.1103.896.095.799.3

濃縮飼料100.8101.198.699.296.9

精料補(bǔ)充料100.498.199.598.898.2

復(fù)合預(yù)混合飼料99.499.1100.7100.697.5

表13固相萃取柱容量考察結(jié)果（二甲氧芐氨嘧啶）

二甲氧芐氨嘧啶平均回收率（%）

樣品類型

500mg/kg800mg/kg1000mg/kg1500mg/kg2000mg/kg

配合飼料96.096.190.390.393.7

濃縮飼料105.595.492.493.791.4

精料補(bǔ)充料102.391.593.793.592.8

復(fù)合預(yù)混合飼料104.691.394.194.492.0

結(jié)果表明，樣品中目標(biāo)化合物含量至少在2000mg/kg以內(nèi)，不會(huì)出現(xiàn)

小柱過(guò)載情況。

24

2.3.6樣品復(fù)溶溶液的確定

樣品經(jīng)乙酸乙酯提取后，準(zhǔn)確移取2.0mL提取液在50℃下氮?dú)獯抵?/p>

干，加入復(fù)溶液溶解殘?jiān)蟛捎肕CX小柱凈化處理。由于二甲氧芐氨嘧

啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶在提取液中處于分子狀態(tài)，因

此需要酸性復(fù)溶液溶解殘?jiān)?，提高目?biāo)化合物離子化效率，才能使用離子

交換小柱凈化樣品，保留目標(biāo)化合物。根據(jù)前期查閱的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)發(fā)

現(xiàn)，二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶易溶于乙酸。

因此我們考察了不同濃度的乙酸溶液對(duì)于回收率的影響，回收率結(jié)果見(jiàn)表

14。

表14不同濃度乙酸溶液回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

化合物

No.1%乙酸2%乙酸3%乙酸4%乙酸5%乙酸8%乙酸10%乙酸

水溶液水溶液水溶液水溶液水溶液水溶液水溶液

二甲氧

162.4577.8880.3674.1483.9969.1274.93

芐胺嘧啶

三甲氧

263.2378.8381.1675.0186.0570.0376.36

芐氨嘧啶

二甲氧甲基

365.5382.6986.3178.9887.2472.0078.12

芐氨嘧啶

結(jié)果表明，5%乙酸溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)MCX固相萃取小柱凈化，二

甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶回收率最高，分別

達(dá)83.99%、86.05%、87.24%，因此，初步采用5%乙酸溶液作為樣品復(fù)溶

溶液。

本試驗(yàn)使用乙酸乙酯作為提取液，對(duì)于脂肪含量較高的樣品，如果加

入5%乙酸水溶液復(fù)溶，經(jīng)渦旋振蕩后復(fù)溶溶液會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。為

了降低乳化，我們考察了不同比例的乙腈-5%乙酸水復(fù)溶液對(duì)于回收率的影

25

響，結(jié)果見(jiàn)表15。結(jié)果表明，乙腈-5%乙酸水溶液（10:90，V/V）作為復(fù)

溶溶液，既能保證較高的回收率，又能夠有效減少乳化現(xiàn)象。

表15不同復(fù)溶溶液回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

化合物乙腈乙酸乙腈乙酸水乙腈乙酸水乙腈乙酸水

No.乙酸-5%-5%-5%-5%

5%水溶液（，溶液（，溶液（，溶液（，

水溶液5:9510:9020:8030:70

V/V）V/V）V/V）V/V）

二甲氧

179.0072.7381.7778.0675.59

芐胺嘧啶

三甲氧

280.7175.2581.9379.8776.93

芐氨嘧啶

二甲氧甲基

382.6276.9986.8581.7378.83

芐氨嘧啶

MCX小柱采用酸性復(fù)溶液過(guò)柱凈化，洗脫時(shí)需要使用堿性溶液破壞小

柱與目標(biāo)化合物的離子鍵。對(duì)于MCX小柱，實(shí)驗(yàn)室一般使用氨化甲醇作

為洗脫液。不同濃度的氨化甲醇對(duì)于洗脫效果會(huì)產(chǎn)生較大的影響，回收率

結(jié)果見(jiàn)表16。結(jié)果表明，8%氨水甲醇平均回收率最高。

表16不同濃度氨水甲醇回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

平均回收率（%）

No.化合物

1%氨水甲醇3%氨水甲醇5%氨水甲醇8%氨水甲醇10%氨水甲醇

二甲氧

159.0757.0066.7671.2968.28

芐胺嘧啶

三甲氧

261.3759.0868.6072.9870.31

芐氨嘧啶

二甲氧甲基

362.4359.8570.4374.3671.00

芐氨嘧啶

2.3.7樣品基質(zhì)效應(yīng)考察

在使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析樣品時(shí)，樣品的一些共同提取物可能

會(huì)對(duì)目標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確定量。

26

對(duì)于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，一般會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)化合物抑制的情況。飼料產(chǎn)品

種類繁多，基質(zhì)復(fù)雜，各種共同提取物會(huì)極大的影響液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀

的靈敏性和精密度，降低檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此需要考察方法的基質(zhì)效

應(yīng)，確定是否需要采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。目前最常采用的評(píng)價(jià)方法

為相對(duì)響應(yīng)值法，即在不考慮回收率的情況下，比較目標(biāo)化合物在空白基

質(zhì)和純?nèi)芤褐械捻憫?yīng)?；|(zhì)效應(yīng)因子（MF）=提取后的空白基質(zhì)加入目標(biāo)

化合物的響應(yīng)/純?nèi)芤褐心繕?biāo)化合物的響應(yīng)。一般認(rèn)為MF在0.81.2之間

認(rèn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，MF高于1.2或者低于0.8認(rèn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。

我們選取仔豬配合飼料、蛋雞濃縮飼料、畜禽用復(fù)合預(yù)混合飼料、肉

牛精料補(bǔ)充料，分別添加成濃度為250μg/kg的二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐

氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶，每種樣品做5個(gè)平行樣進(jìn)行上機(jī)測(cè)定后計(jì)

算基質(zhì)效應(yīng)因子，結(jié)果見(jiàn)表17。

表17不同類型樣品的基質(zhì)效應(yīng)因子（n=5）

基質(zhì)效應(yīng)因子

No.化合物畜禽用復(fù)合

仔豬配合飼料蛋雞濃縮飼料肉牛精料補(bǔ)充料

預(yù)混合飼料

1二甲氧芐胺嘧啶0.9120.9050.9090.902

2三甲氧芐氨嘧啶1.0000.9610.9490.934

3二甲氧甲基芐氨嘧啶0.9290.9130.9230.944

結(jié)果表明，不同類型樣品通過(guò)上機(jī)測(cè)定后計(jì)算得到的基質(zhì)效應(yīng)因子均

在0.9021.000之間，屬于弱基質(zhì)效應(yīng)。本方法采用乙酸鈉溶液加入一定量

的氨水，使目標(biāo)化合物處于完全分子狀態(tài)，再加入一定量的乙酸乙酯進(jìn)行

液液萃取，提取液經(jīng)過(guò)氮吹復(fù)溶后加入正己烷除脂，經(jīng)MCX小柱凈化，

洗脫液氮吹至干后加入復(fù)溶液溶解殘?jiān)瑥?fù)溶液過(guò)濾膜后上機(jī)測(cè)定。液液

27

萃取將大部分的極性基質(zhì)干擾物留在乙酸鈉溶液中，正己烷除脂后大多數(shù)

的非極性化合物被凈化干凈。從而整個(gè)上機(jī)待測(cè)物中的干擾物大大降低，

計(jì)算得到的基質(zhì)效應(yīng)因子在0.9~1.0之間。因此，本試驗(yàn)使用初始流動(dòng)相配

制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。雖然目標(biāo)化合物的共同提取物沒(méi)有影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確

定性，但是考慮到飼料產(chǎn)品的多樣性、復(fù)雜性、降低液質(zhì)儀器的維護(hù)成本、

提高檢測(cè)效率、延長(zhǎng)儀器使用壽命，我們?nèi)匀徊捎霉滔噍腿⌒≈鶅艋姆?/p>

式進(jìn)一步提高待測(cè)液的潔凈程度。本研究考慮到油脂含量高樣品在檢測(cè)過(guò)

程中會(huì)有較為嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象、添加有吸附劑等特殊樣品對(duì)于目標(biāo)化合物

的吸附以及檢測(cè)人員在實(shí)際操作過(guò)程中的誤差，我們采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行目標(biāo)

化合物的定量。

同位素內(nèi)標(biāo)，通常是指化合物結(jié)構(gòu)中部分元素被其同位素取代多形成

的同位素產(chǎn)品，與待測(cè)化合物具有極為相近的理化性質(zhì)，出峰時(shí)間基本一

致。采用同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定量能夠真實(shí)、客觀的反應(yīng)目標(biāo)化

合物的色譜行為，補(bǔ)償人員操作、固相萃取小柱凈化帶來(lái)的誤差。目前市

場(chǎng)上三甲氧芐氨嘧啶同位素生產(chǎn)廠商多，價(jià)格低廉、二甲氧芐氨嘧啶同位

素內(nèi)標(biāo)和二甲氧甲基芐氨嘧啶同位素內(nèi)標(biāo)只有一家國(guó)外廠商供貨，價(jià)格昂

貴、貨期不定。從目標(biāo)化合物總離子流圖可以看出，二甲氧芐氨嘧啶、三

甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶出峰時(shí)間接近，說(shuō)明具有相似的色譜

行為。綜合考慮，本試驗(yàn)采用d9-三甲氧芐氨嘧啶作為內(nèi)標(biāo)對(duì)二甲氧芐氨嘧

啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶進(jìn)行定量分析。

28

2.3.8標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期的確定

2.3.8.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液有效期的確定

為確保檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，依據(jù)目標(biāo)化合物理化性質(zhì)，對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)溶液

穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。分別在0天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月、

6個(gè)月、7個(gè)月和8個(gè)月將目標(biāo)化合物配制成1.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，

放入－18℃以下冰箱冷凍保存。在第8個(gè)月的時(shí)間段，用初始流動(dòng)相將不

同時(shí)間段配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋成50ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，以新配制

的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定濃度。

對(duì)各工作液連續(xù)進(jìn)樣6次考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表18。

表18標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

二甲氧芐氨嘧啶三甲氧芐氨嘧啶二甲氧甲基芐氨嘧啶三甲氧芐氨嘧啶

測(cè)試時(shí)間d9-

（mg/mL）（mg/mL）（mg/mL）（mg/mL）

0天1.001.001.001.00

1個(gè)月1.001.001.001.00

2個(gè)月0.991.000.990.99

3個(gè)月0.990.990.990.98

4個(gè)月0.980.980.980.98

5個(gè)月0.980.980.990.98

6個(gè)月0.970.980.980.98

7個(gè)月0.970.970.970.97

8個(gè)月0.940.960.940.95

結(jié)果表明，當(dāng)測(cè)定時(shí)間距離標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制時(shí)間為8個(gè)月的時(shí)候，

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的濃度與新配制的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度相比降低超過(guò)了5%，因

此為保證標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液穩(wěn)定性，減少試驗(yàn)誤差，并參照GB/T27404－2008

29

中的“標(biāo)準(zhǔn)溶液參考有效期”的要求，同時(shí)考慮到實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備

溶液反復(fù)凍融次數(shù)的頻率較高，最終確定在－18℃以下冷凍保存條件下，

1.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液有效期確定為6個(gè)月。

2.3.8.2標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液有效期的確定

二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶和d9-三甲氧

芐氨嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液（10μg/mL）在－18℃以下保存3個(gè)月，分

別在0天、14天、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月測(cè)定濃度。檢測(cè)數(shù)據(jù)表明標(biāo)準(zhǔn)中

間儲(chǔ)備溶液在－18℃以下保存3個(gè)月后性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)明顯的降解和變化，

結(jié)果見(jiàn)表19。

表19標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

二甲氧芐氨嘧啶三甲氧芐氨嘧啶二甲氧甲基芐氨嘧啶三甲氧芐氨嘧啶

測(cè)試時(shí)間d9-

（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）（μg/mL）

0天10.010.010.010.0

14天10.010.010.010.0

1個(gè)月10.010.09.9910.0

2個(gè)月9.999.999.999.99

3個(gè)月9.999.999.999.99

2.3.9方法學(xué)考察

2.3.9.1線性范圍

準(zhǔn)確移取二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)

中間儲(chǔ)備溶液適量，用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成濃度為0.5ng/mL、1.0ng/mL、

2.0ng/mL、10.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，內(nèi)標(biāo)

濃度均為10.0ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，臨用現(xiàn)配。以標(biāo)準(zhǔn)系

30

列溶液中待測(cè)組分峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待

測(cè)組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，待測(cè)

物在0.5ng/mL～100.0ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各目標(biāo)化合物回

歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）見(jiàn)表20。

表20標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）

線性范圍

No.化合物回歸方程r2

（ng/mL）

1二甲氧芐氨嘧啶0.5～100y=0.234274x+0.0220080.9996

2三甲氧芐氨嘧啶0.5～100y=0.106357x+0.0078800.9998

3二甲氧甲基芐氨嘧啶0.5～100y=0.153222x+0.0111300.9998

2.3.9.2定性和定量測(cè)定

定性測(cè)定在相同試驗(yàn)條件下，試樣中待測(cè)物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中

待測(cè)物的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)，且試樣中各組分的兩個(gè)定性離子的相

對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相應(yīng)定性離子相對(duì)豐度一致，偏差不超過(guò)

表21規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。

表21定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許誤差

相對(duì)離子豐度＞50%20%～50%10%～20%≤10%

允許的最大偏差±20%±25%±30%±50%

定量測(cè)定在儀器最佳工作條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)工作液與試樣交替進(jìn)樣，

采用內(nèi)標(biāo)法定量。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為

縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)組分的濃度和內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)繪制，

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液

中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。當(dāng)試樣的上機(jī)濃度超過(guò)

現(xiàn)性范圍時(shí)，需根據(jù)測(cè)定濃度稀釋后進(jìn)行重新測(cè)定。在上述色譜和質(zhì)譜條

31

件下，二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶和d9-三甲

氧芐氨嘧啶的標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子色譜圖見(jiàn)圖16~圖19。

圖16二甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

32

圖17三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖18二甲氧甲基芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

33

圖19d9-三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3.9.3方法檢出限和定量限

將儀器條件優(yōu)化至最佳后，確定方法的檢出限和定量限，具體操作如

下。

檢出限（LOD）：添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白樣品中，經(jīng)提取凈化處理

后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，依據(jù)分析物信噪比S/N>3，確定方法檢出

限為2.5μg/kg。定量限（LOQ）：添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白樣品中，經(jīng)提

取凈化處理后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，依據(jù)分析物信噪比S/N>10，確

定方法定量限為5.0μg/kg。

本試驗(yàn)根據(jù)信噪比計(jì)算得到的定量限進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，加標(biāo)回

收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表22~表28。

34

表22黃顙魚配合飼料定量限加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

批內(nèi)批間

添加濃度平均回收

待測(cè)組分批次回收率（%）RSDRSD

（μg/kg）率（%）

（%）（%）

Ⅰ99.9106.298.1107.4104.4106.4103.73.68

二甲氧芐氨嘧啶Ⅱ97.696.399.294.691.792.495.33.095.34

Ⅲ93.795.480.392.593.095.091.66.20

Ⅰ103.4105.0106.7100.0102.299.4102.82.76

5三甲氧芐氨嘧啶Ⅱ104.3101.397.