SC-T 7028-2022 水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查規(guī)范 通則

ＩＣＳ

CCS

B

50備案號：XXXX-XXXX中華人民共和國水產(chǎn)行業(yè)標準SC／Ｔ

7028—2022

2022－

11－

11

2023－

03－

01

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布SC/T

７０２８—２０２２前言本文件按照

GB/T１１—２０２０?標準化工作導(dǎo)則第１部分:標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則?的規(guī)定起草.請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利.本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任.本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局提出.S本文件由全國水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會(AC/TC１５６)歸口.S本文件起草單位:全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所.本文件主要起草人:劉忠松、鄧玉婷、陳艷、陳學(xué)洲、姜蘭、馮東岳、宋晨光.ⅠSC/T

７０２８—２０２２水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查規(guī)范范圍本文件界定了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查規(guī)范的術(shù)語和定義,確立了水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌耐藥性調(diào)查流程,規(guī)定了細菌耐藥性調(diào)查中樣品采集、信息采集、細菌分離鑒定、菌株保存、藥物敏感性試驗、結(jié)果判定和結(jié)果記錄與統(tǒng)計的要求,描述了上述各步驟相應(yīng)追溯或證實的方法.本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌對漁用抗菌藥物的耐藥性調(diào)查.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款.其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件.分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法水生動物病原菌實驗室保存規(guī)范術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件.３１３２３３３４３５３６

ei采樣點samplei同一水域、同一品種、相同環(huán)境及養(yǎng)殖條件的養(yǎng)殖場為一個采樣點.t i最小抑菌濃度minimalinhibioryconcentatont i在采用稀釋法測定藥物敏感性的試驗中,能抑制細菌生長的最低抗菌藥物濃度.折點breakpointi

e用于區(qū)分菌株為敏感、中介和耐藥的

MICi

e敏感susceptble抗菌藥物對菌株的

MIC值等于或低于敏感折點,即菌株對該藥物表現(xiàn)為敏感.e中介intrmediatit抗菌藥物對菌株的

MIC值在高于敏感折點且低于耐藥折點的范圍內(nèi),即菌株對該藥物表現(xiàn)為中介it耐藥ressant抗菌藥物對菌株的

MIC值等于或高于耐藥折點,即菌株對該藥物表現(xiàn)為耐藥.耐藥性調(diào)查流程細菌耐藥性調(diào)查按以下流程進行:a)樣品采集;b)信息采集;c)細菌分離鑒定;１SC/T

７０２８—２０２２d)菌株保存;e)藥物敏感性試驗(微量肉湯稀釋法);f)結(jié)果判定;g)結(jié)果記錄與統(tǒng)計.耐藥性調(diào)查的實施５１樣品采集５１１采樣對象水產(chǎn)養(yǎng)殖動物,每尾(個)動物個體為一個樣品.５１２

采樣頻次每個采樣點每年至少３次,每次間隔２個月或以上.５１３采樣數(shù)量每個采樣點每次采集不少于１０個樣品,全年不少于３０個樣品.５１４樣品采集、保存及運輸樣品采集后分別放置于清潔、干燥、密封的容器中,且存放溫度為０℃,應(yīng)在內(nèi)進行細菌分離.每個樣品分別加貼采樣標簽,注明采樣地、采樣編號、采樣人和采樣日期.５２信息采集采樣人員記錄養(yǎng)殖場基本信息和樣品來源信息.按附錄

A的要求填寫采樣記錄表.５３細菌分離鑒定根據(jù)不同細菌分別選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和鑒定方法.對樣品進行細菌分離培養(yǎng),采用生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)等方法對分離菌株進行菌種鑒定.每個樣品分離菌株１株~２株,每個采樣點每年分離菌株不少于３０株.５４菌株保存分離的菌株若不能及時進行藥物敏感性試驗,應(yīng)置于０℃~４℃

冰箱中保存,時間不超過４８h;或按照的規(guī)定,采用甘油保存法或真空冷凍干燥法,置于－２０℃或－８０℃冰箱中保存.５５藥物敏感性試驗采用微量肉湯稀釋法對分離菌株進行藥物敏感性測定.具體操作方法和步驟按附錄B的規(guī)定進行.５６結(jié)果判定根據(jù)不同抗菌藥物對受試菌的

MIC值結(jié)果,將菌株判定為敏感、中介或耐藥.不同細菌的耐藥性判定參考值見附錄C.５７結(jié)果記錄與統(tǒng)計１ ２ ３將每一受試菌的菌株編號、菌種名稱、對各種藥物的

MIC結(jié)果以及判定結(jié)果記錄于藥物敏感性１ ２ ３結(jié)果記錄表中,見附錄D.按照公式()、公式()、公式()分別計算分離菌株的敏感率、中介率及耐藥率.１２３敏感率＝(敏感菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()１２３中介率＝(中介菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()耐藥率＝(耐藥菌株數(shù)/受試菌株總數(shù))×１００％

()２場名:聯(lián)系人:電話:地址:主要養(yǎng)殖品種::□

≤１０□１１~１００□

＞１００養(yǎng)殖模式::□~２□~５□動物品種:樣品數(shù)量::;采樣部位:發(fā)病情況:使用抗菌藥物情況:():():采樣時間:

SC/T

７０２８—２０２２附錄A(規(guī)范性)采樣記錄表采集養(yǎng)殖場基本信息和樣品來源信息等按表

A１的要求填寫.表表A１采樣記錄表藥物名稱儲備液濃度μg/mL溶劑稀釋劑氟苯尼考３２０９５％

磺胺間甲氧嘧啶２０４８０c２５mol/LNaOH

a磺胺甲

１２１６０c２５mol/LNaOH

a６４０００５mol/L,１０％cb８０/２,mol/LNaOH

鹽酸多西環(huán)素１６０a,,,.b,.c,.SC/T

７０２８—２０２２附錄B(規(guī)范性)藥物敏感性試驗(微量肉湯稀釋法)B試劑和材料B１１抗菌藥物B１１１標準品氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲

唑、甲氧芐啶和恩諾沙星等.B１１２抗菌藥物儲備液的制備B１１２１抗菌藥物粉劑的稱量B Bμ抗菌藥物粉劑應(yīng)在分析天平上稱量,并且根據(jù)公式(B Bμ重量(mg)＝濃度(g/mL)×容量(mL)÷含量(％)×０００１

(B１１２２溶劑與稀釋劑各藥物的溶劑與稀釋劑見表試驗用水應(yīng)符合

中三級水的要求.表B１抗菌藥物儲備液所用的溶劑和稀釋劑B１１２３溶劑與稀釋劑將稱取的抗菌藥物溶解于無菌水或溶劑中表B１抗菌藥物儲備液所用的溶劑和稀釋劑B１１２３溶劑與稀釋劑４制備完的藥液,置于４℃冰箱中保存,

周內(nèi)使用.４B１２水解酪蛋白(,MH)肉湯培養(yǎng)基按產(chǎn)品說明用干粉培養(yǎng)基配制

MH

肉湯,試驗用水應(yīng)符合

GB/T６６８２中三級水的要求.針對需要復(fù)雜營養(yǎng)的細菌,應(yīng)在

MH

肉湯里添加適宜其生長的物質(zhì).B１３質(zhì)控菌株E大腸埃希氏菌(scherichiacol

EB１４９６孔板宜選用規(guī)格１０７mm

×１００mm×１６９mm、聚苯乙烯材質(zhì)、U型孔底、帶蓋、每孔可容納液體的無菌９６孔板.B儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、高壓滅菌鍋、分析天平、電熱鼓風(fēng)干燥箱、冰箱、移液器、超凈工作臺等.B抗菌藥物稀釋取滅菌

MH

肉湯,在無菌９６孔板的第１孔加入１６０μL,在第２孔至第１０孔中分別加入１００μL.在第１孔中加入抗菌藥儲備液４０μL,吹打混勻;取第１孔中的含藥肉湯至第２孔中吹打混勻;吸?。此幬锩Q,μg/mL１０１１１２氟苯尼考A３２１６０５０２５０１２５００６陽性對照空白對照鹽酸多西環(huán)素B１６０５０２５０１２５００６００３陽性對照空白對照磺胺間甲氧嘧啶C２０４８１０２４５１２２５６１２８６４３２１６陽性對照空白對照磺胺甲

/甲氧芐啶D６０８/３２３０４/１６１５２/９５/０５４３/０２５２４/０１２１２/００６陽性對照空白對照恩諾沙星E０５０２５０１２５００６２５００３００１５陽性對照空白對照注:“陽性對照”為不含藥液的菌懸液;“空白對照”為不含藥液和不含菌懸液

MH

肉湯.藥物類別藥物名稱MIC,μg/mL酰胺醇類氟苯尼考４~１６四環(huán)素類多西環(huán)素０５~２磺胺類磺胺甲

/０６/００３~４８/０２５磺胺間甲氧嘧啶８~３２喹諾酮類恩諾沙星０００８~００３SC/T

７０２８—２０２２第２孔中的含藥肉湯至第３孔中吹打混勻.重復(fù)上述操作,將藥物進行２倍倍比稀釋,當(dāng)?shù)冢保翱紫♂屚旰髼壢ノ龅暮幦鉁保埃唉蘈,使含有藥物的

MH

肉湯每一孔均為１００μL.B細菌

MIC值測定B４１菌懸液制備根據(jù)不同細菌分別選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,將純化的受試菌株接種于適宜的培養(yǎng)基中,取對數(shù)生長期的培養(yǎng)物,用比濁儀或麥氏比濁管測定校正菌液濁度為０２５~１麥氏濁度標準,再用

MH

肉湯稀釋２００倍,制備成用于接種的菌懸液(菌懸液濃度為４０×１０

CFU/mL~１６×１０

CFU/mL).B４２對照設(shè)立配制的菌懸液應(yīng)在１５min內(nèi)加入已稀釋好抗菌藥物的９６孔板第１孔至第１０孔中,每孔各１００μL.設(shè)不含抗菌藥物的菌懸液作為陽性對照,設(shè)不含藥物和菌懸液的

MH

肉湯作為空白對照.每一受試菌株單獨使用一塊９６孔板.接種后,每孔抗菌藥物的終濃度見表

接種后菌液的終濃度為２０×１０CFU/mL~８０×１０

CFU/mL.表B２抗菌藥物在９６孔板中各孔的終濃度B４３孵育加樣完畢后,蓋好板蓋.將表B２抗菌藥物在９６孔板中各孔的終濃度B４３孵育菌分別選擇適宜的培養(yǎng)條件.B４４MIC值判讀空白對照孔不得有細菌生長,陽性對照孔有明顯的渾濁才可判讀.沒有細菌生長的孔所對應(yīng)的最低濃度為

MIC值.如存在一個跳孔現(xiàn)象時,應(yīng)讀最高的

MIC值,多于一個跳孔時應(yīng)重測.B質(zhì)量控制測定每一批次受試菌前,應(yīng)測定質(zhì)控菌株大腸埃希氏菌

ATCC２５９２２對試驗藥物的

MIC值,對配制的藥物及藥物稀釋過程進行質(zhì)量控制,測定方法見不同抗菌藥物的質(zhì)控范圍見表如果質(zhì)控菌株的結(jié)果明顯偏離質(zhì)控范圍,應(yīng)查找原因重新配制藥物進行測定或從指定菌種保藏機構(gòu)更換新的標準菌株.表表B３大腸埃希氏菌ATCC２５９２２質(zhì)控范圍５藥物類別藥物名稱,μg/mL敏感中介耐藥酰胺醇類氟苯尼考≤２≥８四環(huán)素類鹽酸多西環(huán)素≤４≥１６a≤１ba≥２磺胺類磺胺甲

/≤３８/２≥７６/４a≤９５/０５a１９/１~３８/２a≥７６/４磺胺間甲氧嘧啶≤２５６≥５１２喹諾酮類恩諾沙星≤０５１－２≥４a

,

/,.b“—”.SC/T

７０２８—２０２２附錄C(資料性)細菌耐藥性判定參考值表C１給出了細菌對不同抗菌藥物的耐藥性判定參考值.表表C１細菌耐藥性判定參考值采樣點