超微量分光光度計(jì)

第第頁超微量分光光度計(jì)常見的用途無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境贈(zèng)疊科學(xué)等科學(xué)討論領(lǐng)域,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測(cè)、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門,紫外可見分光光度計(jì)督有廣泛而緊要的應(yīng)用。分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。超微量分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物試驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。核酸的定量核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率最高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高汲取峰的汲取波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，試驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是試驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在肯定范圍內(nèi)變化，即儀器有肯定的精準(zhǔn)度和精準(zhǔn)明確度。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計(jì)的精準(zhǔn)度≤1.0%（1A）。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等:在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值肯定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避開存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了大程度削減顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1—1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測(cè)試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至顯現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移猛烈；必需使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采納窗口磨損的比色杯；樣品的體積必需達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)特別緊要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，由于蛋白的汲取峰是280nm。純潔的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純潔的核酸A260/A230的比值大于2.0、A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0、蛋白質(zhì)直接定量這種方法是在280nm波長，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸樂棕光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過程特別簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要除去320nm的"背景"信息，設(shè)定此功能"開"。與測(cè)試核酸仿佛，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0—1.5之間。試驗(yàn)中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)覺讀數(shù)"漂移"。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要察看A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果特別穩(wěn)定。漂移的原因是由于Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以肯定的系數(shù)，只要吸光值有少許更改，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純潔、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來說，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是簡(jiǎn)單受到平行物質(zhì)的干民笑射擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry等幾種方法。Lowry法:以最早期的Biuret反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要次序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長；簡(jiǎn)單受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Tritonx—100，ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。BCA（Bicinchoninineacidassay）法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2反應(yīng)產(chǎn)生Cu，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，汲取峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物特別穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相像的是簡(jiǎn)單受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物汲取峰595nm。其最大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry和BCA兩種測(cè)試方法的2倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，便利結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依舊是敏感的。最重要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。某些初次接觸比色法測(cè)定的討論者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到懷疑，到底該信任哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如:Keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，找尋化學(xué)構(gòu)成仿佛的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，常常顯現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的緊要配件——比色杯的顏色是有肯定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，全部的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必需在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響試驗(yàn)的緊要原因。此外，特別緊要的是，最好是用塑料的比色法。避開使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，由于反應(yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不精準(zhǔn)。OD600試驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多依據(jù)閱歷和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長密度。在碰到要求較高的試驗(yàn)，需要采納分光光度計(jì)精準(zhǔn)測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培育物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培育液作為空白液，之后定量培育后的含菌培育液。為了保證正確操作，必需針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。試驗(yàn)中偶然會(huì)顯現(xiàn)菌液的OD值顯現(xiàn)負(fù)值，原因是采納了顯色的培育基，即細(xì)菌培育一段時(shí)間后，與培育基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。重要結(jié)構(gòu)各種型號(hào)的分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)都相同，由如下五種部分構(gòu)成:1）光源（鎢燈、鹵鎢燈，氫弧燈，氘燈、氙燈或激光光源）；2）單色器（濾光片、棱鏡、光柵、全息柵）；3）樣品汲取池；4）檢測(cè)系統(tǒng)（光電池、光電管、光電倍增管）；5）信號(hào)指示系統(tǒng)（檢流計(jì)、微安表、數(shù)字電壓表、示波器、微處理機(jī)顯像管）。光源—單色器—樣品汲取池—檢測(cè)系統(tǒng)—信號(hào)指示系統(tǒng)。區(qū)分內(nèi)容與傳統(tǒng)光度計(jì)的區(qū)分傳統(tǒng)分光光度計(jì):樣品體積要求大，絕大部分要50μL以上需使用比色皿每次換樣品時(shí)，比色杯需要清洗，工作繁重光程一般為10mm，樣品需要稀釋，測(cè)量濃度范圍小燈源一般由氘燈（紫外）和鎢燈（可見）構(gòu)成，壽命短需要預(yù)熱半個(gè)小時(shí)以上顯示吸光度值，不顯示濃度值儀器體積大，質(zhì)量重超微量分光光度計(jì)所需樣品體積小，僅需1～2μL不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到