HYT 216-2017 河豚毒素檢測(cè)方法（正式版）

河豚毒素檢測(cè)方法DeterminationoftetrodotoxinI 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 5試劑 6儀器與設(shè)備 27樣品的制備和保存 8樣品測(cè)定 39結(jié)果的表示與計(jì)算 310精密度 411實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 4附錄A(資料性附錄)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及陽(yáng)性樣品的高效液相色譜圖 5附錄B(資料性附錄)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖 6附錄C(資料性附錄)回收率數(shù)據(jù) 7附錄D(資料性附錄)再現(xiàn)性數(shù)據(jù) 9Ⅲ本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家海洋局第三海洋研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：國(guó)家海洋局第三海洋研究所、國(guó)家海洋局海洋標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心。1河豚毒素檢測(cè)方法警告——由于河豚毒素是劇毒的固體粉末，因此使用時(shí)應(yīng)戴口罩和手套，注意避免吸入，配成溶液時(shí)避免與人體直接接觸。若不慎接觸到皮膚或眼部，應(yīng)用大量水沖洗。嚴(yán)重時(shí)，立即送及本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)中(不含其制品)河豚毒素的高效液相色譜熒光檢測(cè)法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)中(不含其制品)河豚毒素的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)河豚毒素的檢出限為0.1mg/kg,定量限為0.25mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6379.2測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度(正確度與精密度)第2部分：確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。某些鲀科魚(yú)類(lèi)(如東方鲀)體內(nèi)所含的外源神經(jīng)毒素，以血液和內(nèi)臟器官的含量最多。小劑量有麻痹和鎮(zhèn)痛作用，劑量稍大便可致死人命。結(jié)構(gòu)式如下：4原理利用河豚毒素溶于弱酸的性質(zhì)進(jìn)行提取，河豚毒素在強(qiáng)堿中可產(chǎn)生具有熒光性衍生物原理，采用柱后衍生-高效液相色譜熒光法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)保留時(shí)間定性分析，峰面積定量分析。除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和超純水或相當(dāng)純度的水。25.1辛烷磺酸鈉(C?H?NaO?S),色譜純。5.2二水合磷酸二氫鈉(NaH?PO?·2H?O)。5.4氫氧化鈉(NaOH)。5.5乙酸(CH?COOH),色譜純。5.6辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液：取辛烷磺酸鈉(5.1)0.540g、二水合磷酸二氫鈉(5.2)3.900g和十二水合磷酸氫二鈉(5.3)8.954g,加水稀釋定容至500mL,配置成辛烷磺酸鈉濃度為1.080g/L,二水合磷酸二氫鈉濃度為7.800g/L,十二水合磷酸氫二鈉濃度為17.908g/L的混合溶液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜5.7氫氧化鈉溶液：稱(chēng)取160g氫氧化鈉(5.4),以水溶解并稀釋至1L,濃度為4mol/L,經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。5.80.1%乙酸溶液：乙酸(5.5)+水(1+1000,體積比),用玻璃瓶貯存，室溫保存。5.90.03%乙酸溶液：乙酸(5.5)+水(3+10000,體積比),用玻璃瓶貯存，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.10標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品10mg(精確至0.01mg),置于100mL容量瓶中，加0.03%乙酸溶液(5.9)溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，其濃度為0.100mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)容器中，在4℃±2℃保存時(shí)，儲(chǔ)備液可保存一個(gè)月。6儀器與設(shè)備6.2數(shù)顯控溫?cái)嚢杵鳌?.3高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不小于12000r/min。6.4液相色譜儀配熒光檢測(cè)器和柱后衍生裝置。6.8水浴鍋。7樣品的制備和保存7.1樣品的保存與預(yù)處理新鮮貝類(lèi)樣品清洗瀝干去殼，新鮮魚(yú)類(lèi)樣品清洗后去皮取魚(yú)肉。未能及時(shí)處理的樣品應(yīng)于一20℃7.2樣品的提取樣品按以下步驟進(jìn)行提取：a)取預(yù)處理后的樣品(7.1),用組織勻漿器磨成糊狀；b)稱(chēng)取5.0g(精確至0.001g)樣品于燒杯中，加10mL0.1%乙酸溶液(5.8),在50℃水浴中攪拌加熱10min,全部移至離心管中；c)再用5mL0.1%乙酸溶液(5.8)洗滌燒杯，并轉(zhuǎn)移到離心管，以12000r/min轉(zhuǎn)速離心20min后，取上清液轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶中；d)再分別用10mL0.1%乙酸溶液(5.8)洗滌沉淀3次，離心后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用0.03%乙酸溶液(5.9)定容。37.3樣品提取液的保存上述方法處理好的樣品(7.2)未及時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)，常溫下可放置8h。8樣品測(cè)定8.1色譜條件宜采用以下色譜條件：c)流動(dòng)相：辛烷磺酸鈉的磷酸鹽緩沖液(5.6);e)激發(fā)波長(zhǎng)365nm,發(fā)射波長(zhǎng)510nm;8.2定性分析待測(cè)樣品中目標(biāo)化合物的色譜峰根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間確認(rèn)。8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用0.03%乙酸溶液(5.9)逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.10),配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度分別為8.1規(guī)定的色譜條件，按濃度從低到高依次測(cè)定上述標(biāo)準(zhǔn)工作液，以峰面積為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃取按上述制備樣(7.2)適量，經(jīng)0.45μm微孔濾膜(6.5)過(guò)濾后，進(jìn)行液相色譜測(cè)定。待測(cè)樣中河豚毒素的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍則稀釋后再進(jìn)樣測(cè)定。用水作為空白樣品，按照7、8章的規(guī)定進(jìn)行空白試驗(yàn)。9結(jié)果的表示與計(jì)算按式(1)計(jì)算樣品河豚毒素含量： (1)式中：x——被測(cè)樣品中的河豚毒素含量，單位為毫克每千克(mg/kg);A,——被測(cè)樣品中的河豚毒素峰面積；c;s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中的河豚毒素濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);4A;——標(biāo)準(zhǔn)溶液中的河豚毒素峰面積；m——樣品的質(zhì)量，單位為克(g);V——樣品的定容體積，單位為毫升(mL)。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。10精密度在重復(fù)性條件下，對(duì)同一被測(cè)對(duì)象相互獨(dú)立進(jìn)行測(cè)試獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的10%。在再現(xiàn)性條件下獲得的實(shí)驗(yàn)室間的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)附錄D。11實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意以下事項(xiàng)：a)高效液相色譜儀在使用結(jié)束后，應(yīng)先將柱后衍生裝置與色譜柱斷開(kāi)，色譜柱按常規(guī)洗柱方法進(jìn)行清洗，衍生泵用純水低流速?zèng)_洗衍生泵2h以上；b)試驗(yàn)過(guò)程中，剩余的河豚毒素樣品溶液不應(yīng)隨意丟棄，應(yīng)加入堿溶液處理后再倒入廢液中；c)試驗(yàn)過(guò)程中，相關(guān)的器皿和器具應(yīng)先采用堿溶液處理后再按常規(guī)清洗。5(資料性附錄)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品及陽(yáng)性樣品的高效液相色譜圖圖A.1給出了河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品的高效液相色譜圖，圖A.2給出了陽(yáng)性河豚魚(yú)肉樣品的高效液相品圖A.1河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品(2.16μg/mL)的高效液相色譜圖品時(shí)間/min圖A.2陽(yáng)性河豚魚(yú)肉樣品的高效液相色譜圖6峰面積峰面積(資料性附錄)河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖圖B.1給出了河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖B.1河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖7(資料性附錄)回收率試驗(yàn)：選取羅非魚(yú)(俗稱(chēng)非洲鯽魚(yú))、花蛤和織紋螺作為代表樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，河豚毒素的添加量及回收率的試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表C.1～表C.3。表C.1羅非魚(yú)的加標(biāo)回收率結(jié)果回收率/%回收率平