GBT 43173-2023 種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化規(guī)程（正式版）

種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化規(guī)程2023-09-07發(fā)布國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：四川大學(xué)、中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、山東農(nóng)業(yè)1種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化規(guī)程1范圍本文件確立了種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化程序，規(guī)定了雞白痢陽(yáng)性雞淘汰、凈化雞群生物安全措施等階段的操作指示，描述了凈化效果評(píng)估方法。本文件適用于種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌的凈化。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T5750.2生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法水樣的采集與保存GB/T13091飼料中沙門氏菌的測(cè)定GB/T25886養(yǎng)雞場(chǎng)帶雞消毒技術(shù)要求GB/T36195畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。種雞場(chǎng)breedingchickenfarm飼養(yǎng)曾祖代、祖代或父母代種雞的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)。由雞白痢沙門菌引起以雛雞下痢和敗血癥、成年雞隱性感染為特征的傳染病。在一個(gè)飼養(yǎng)場(chǎng)或指定區(qū)域內(nèi)，通過持續(xù)檢測(cè)和監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性雞只，并通過淘汰陽(yáng)性雞只和維持陰性雞群的生物安全措施，以消除本場(chǎng)雞群雞白痢沙門菌感染的過程。4種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化程序種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化程序包含3個(gè)階段，其中第一階段為雞白痢陽(yáng)性雞淘汰，第二階段為凈化雞群生物安全措施，第三階段為凈化效果評(píng)估。程序流程如圖1所示。2GB/T43173—20233日齡～8日齡雛雞(見5.1)90門齡～120門齡青年雞(見5.2)120日齡以后的種雞(見5.3)種雞場(chǎng)生產(chǎn)管理(見6.1)種雞場(chǎng)消毒及檢測(cè)(見6.2)飲用水處理及檢測(cè)(見6.3)飼料處理及檢測(cè)(見6.4)雞糞、粉塵處理(見6.5)記錄和分析(見6.6)凈化雞群生物安全措施(見第6雞白痢陽(yáng)性雞淘汰(見第5章)凈化評(píng)估(見章)圖1種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌凈化程序流程圖5雞白痢陽(yáng)性雞淘汰5.13日齡～8日齡雛雞5.1.1樣品采集采集3日齡～8日齡雛雞泄殖腔拭子樣品，每10只雞泄殖腔拭子樣品混合為1份進(jìn)行雞白痢病原檢測(cè)。5.1.2檢測(cè)方法5.1.2.1按照附錄A中A.1進(jìn)行雞白痢沙門菌的分離或按照A.2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。5.1.2.2復(fù)檢：任一方法檢測(cè)出的雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性樣品，采用相同方法對(duì)所檢樣品的每一只雞進(jìn)行復(fù)檢。5.1.3檢測(cè)后的處理對(duì)復(fù)檢結(jié)果為陽(yáng)性雞只進(jìn)行淘汰和無害化處理，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性雞所在棟舍按照GB/T行消毒。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞只按照第6章生物安全措施進(jìn)行飼養(yǎng)。25886要求進(jìn)5.290日齡～120日齡青年雞5.2.1樣品采集采集90日齡～120日齡青年雞的全血或血清樣品進(jìn)行雞白痢沙門菌抗體檢測(cè)；或采集泄殖腔樣品，每10只雞泄殖腔拭子樣品混合為1份進(jìn)行雞白痢沙門菌病原檢測(cè)。5.2.2檢測(cè)方法5.2.2.1采集的全血或血清樣品，采用平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)雞白痢沙門菌抗體，按照A.3進(jìn)行。35.2.2.2采集雞泄殖腔拭子樣品，按照A.1進(jìn)行雞白痢沙門菌的分離或按照A.2進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。5.2.2.3復(fù)檢：任一方法檢測(cè)出的雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性樣品，采用相同方法對(duì)所檢樣品的每一只雞進(jìn)行復(fù)檢。5.2.3檢測(cè)后的處理對(duì)復(fù)檢結(jié)果為陽(yáng)性雞只進(jìn)行淘汰和無害化處理，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性雞所在棟舍按照GB/T行消毒。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞只按照第6章生物安全措施進(jìn)行飼養(yǎng)。25886要求進(jìn)種雞群120日齡以后，每間隔3個(gè)月，按照20%比例采集全血或血清樣品進(jìn)行雞白痢沙門菌抗體檢測(cè)?；虬凑?0%的比例采集泄殖腔樣品，每10只雞泄殖腔拭子樣品混合為1份進(jìn)行雞白痢沙門菌病原檢測(cè)。5.3.3檢測(cè)后的處理5.3.3.1對(duì)復(fù)檢結(jié)果為陽(yáng)性雞只進(jìn)行淘汰和無害化處理，同時(shí)對(duì)陽(yáng)性雞所在棟舍按照GB/T25886要求進(jìn)行消毒。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞只按照第6章進(jìn)行管理。5.3.3.2若樣品陽(yáng)性率超過0.2%,則采用相同方法增加全群普檢1次，淘汰和無害化處理陽(yáng)性雞。對(duì)檢測(cè)為陰性的雞只按照第6章生物安全措施進(jìn)行飼養(yǎng)。6凈化雞群生物安全措施6.1種雞場(chǎng)生產(chǎn)管理6.1.1種雞場(chǎng)同一品種雞執(zhí)行全進(jìn)全出制度。6.1.2飼養(yǎng)已經(jīng)凈化的品系時(shí)，避免不同品種或不同來源的種雞在同一雞場(chǎng)飼養(yǎng)而發(fā)生交叉感染。6.1.3一個(gè)雞場(chǎng)在同一時(shí)期只能飼養(yǎng)同一來源的種雞。6.1.4開展本場(chǎng)投入品(飼料、飲水、疫苗等)的沙門菌檢測(cè)，避免外來病原傳入風(fēng)險(xiǎn)。6.1.5不同來源的種蛋在孵化和出雛之時(shí)分開，避免與其他雞群(特別是非凈化雞群)同時(shí)孵化和出雛，防止孵化交叉感染。6.1.6雞白痢陰性群的工作人員、物品、用具、設(shè)備等均需固定化，避免其他雞群的工作人員進(jìn)入實(shí)施凈化的雞群中工作。6.2種雞場(chǎng)消毒及檢測(cè)6.2.1對(duì)引進(jìn)雛雞前對(duì)雞舍及周邊環(huán)境進(jìn)行全面消毒，消毒后采集雞舍內(nèi)墻角、雞籠、地面、墻面等拭子樣品按照A.1或A.2中的方法對(duì)雞白痢沙門菌進(jìn)行檢測(cè)，確保雞舍環(huán)境無雞白痢沙門菌污染。6.2.2每月采用沉降法對(duì)雞舍空氣中細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果制定消毒程序，并按照GB/T25886進(jìn)行消毒。46.3飲用水處理及檢測(cè)6.3.1雞場(chǎng)飲水應(yīng)進(jìn)行凈化處理，可采用酸化劑(酸性電解水等)進(jìn)行飲水消毒，使飲水達(dá)到GB5749要求。6.3.2每3個(gè)月按照GB/T5750.2的規(guī)定進(jìn)行雞場(chǎng)飲水樣品采集，進(jìn)行沙門菌病原檢測(cè)，檢測(cè)方法按照A.1或A.2的方法進(jìn)行。通過檢測(cè)確保水中無雞白痢沙門菌污染。6.4飼料處理及檢測(cè)6.4.1雞場(chǎng)飼料儲(chǔ)運(yùn)過程需實(shí)現(xiàn)全封閉。6.4.2飼料中沙門菌檢測(cè)應(yīng)按照GB/T13091的規(guī)定進(jìn)行，檢測(cè)不合格原料和成品不應(yīng)使用。6.5.1雞場(chǎng)雞糞每天進(jìn)行清理，地面平養(yǎng)墊料及時(shí)翻耙，避免潮濕或結(jié)塊。糞便的無害化處理應(yīng)符合GB/T36195的規(guī)定。6.5.2每周對(duì)雞舍內(nèi)和雞舍尾端粉塵進(jìn)行清理。6.6記錄和分析對(duì)6.1～6.5中涉及操作進(jìn)行記錄，每月進(jìn)行1次統(tǒng)計(jì)分析。且保存記錄應(yīng)不少于3年。7凈化效果評(píng)估7.1評(píng)估方法90日齡以內(nèi)雞只采集300份種雞泄殖腔拭子，超過90日齡雞只采集300份血清樣品或300份泄殖腔拭子樣品。按照A.1、A.2或A.3任一檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法為準(zhǔn)。7.2凈化效果判定曾祖代、祖代種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性率低于0.2%,父母代雞場(chǎng)雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性率低于0.5%,且公雞雞白痢沙門菌病原或抗體陽(yáng)性率為0,種雞場(chǎng)連續(xù)2年以上無雞白痢臨床病例，即認(rèn)為本場(chǎng)達(dá)到雞白痢沙門菌凈化狀態(tài)。5(規(guī)范性)種雞場(chǎng)雞白痢沙門菌抗體、病原檢測(cè)方法A.1.1采集樣品加入5mL緩沖蛋白胨水(BPW)前增菌液中，置于37℃搖床中，220r/min培養(yǎng)A.1.2取培養(yǎng)后的前增菌液0.5mL加入4.5mL四硫磺酸鈉煌綠基礎(chǔ)(TTB)增菌液中，置于42℃搖床中，220r/min培養(yǎng)18h～24h。A.1.3接種針蘸取培養(yǎng)后的TTB增菌液，三區(qū)劃線于木糖賴氨酸脫氧膽酸瓊脂(XLD)或木糖賴氨酸硫酸四癸鈉瓊脂(XLT4)選擇性培養(yǎng)基平板，倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h～24h。A.2雞白痢沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)A.2.1雞白痢沙門菌的增菌培養(yǎng)采集樣品加入緩沖蛋白胨水(BPW)前增菌液中，置于37℃搖床中，220r/min培養(yǎng)18h～24h。取1mL培養(yǎng)液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢樣品基因組DNA。同時(shí)培養(yǎng)雞白痢(CVCC535)標(biāo)準(zhǔn)株，提取DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。A.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系雞白痢沙門菌SEP基因作為特異性檢測(cè)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列及探針見表A.1,實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系見表A.2。選擇FAM通道檢測(cè)雞白痢沙門菌熒光信號(hào)；設(shè)置反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s;95℃變性5s,60℃退火30s,共40個(gè)循環(huán)，于每一循環(huán)結(jié)束時(shí)收集FAM熒光信號(hào)；設(shè)置反應(yīng)體系為20μL。表A.1雞白痢沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列名稱引物序列片段大小熒光標(biāo)記探針SEP1-ForwardF5'-CCCGGATTGGACCTCAAGTG-3'5'6-FAM3'BHQ1SEP1-ReverseF5'-ATGTTACGGGACGAGTGGGT-3'SEP1-ProbeF5'-ACGCACAATCACTGTGCGACCATCCGG-3'表A.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系組分體積/μL2×TaqManFastqPCR預(yù)混液上游引物下游引物6組分體積/μLTaqMan探針無菌無核酸酶水5總計(jì)A.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果的判定當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照Ct值小于或等于28.0且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct值無擴(kuò)增曲線時(shí)，試驗(yàn)成立。當(dāng)被檢樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值小于或等于35.0時(shí)，判為雞白痢沙門菌核酸陽(yáng)性；被檢樣品無Ct值，判為雞白痢沙門菌核酸陰性；對(duì)于Ct值大于35.0的樣品且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時(shí)應(yīng)重檢，如重檢Ct值小于或等于35.0時(shí)，判為雞白痢沙門菌核酸陽(yáng)性，否則判為陰性。A.3雞白痢沙門菌抗體平板凝集檢測(cè)方法A.3.1材料準(zhǔn)備A.3.1.1雞傷寒和雞白痢多價(jià)染色平板抗原。標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性血清(500IU/mL)、弱陽(yáng)性血清A.3.2操作步驟在20℃~25℃環(huán)境條件下，用移液器或吸管吸取抗原，垂直滴于玻璃板上1滴(約0.05mL),然后用消毒的針頭刺破雞的翅靜脈或冠尖，取血0.05mL(相當(dāng)于內(nèi)徑7.5mm～8.0mm金屬絲環(huán)的兩滿環(huán)血液)或者0.05mL血清，與抗原混合均勻，并使其散開至直徑約為2cm,計(jì)時(shí)判定結(jié)果。同時(shí)，設(shè)強(qiáng)陽(yáng)性血清、弱陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照。A.3.3結(jié)果判定在2min內(nèi)，抗原與強(qiáng)陽(yáng)性血清呈100%凝集(++++),弱陽(yáng)性血清呈50%凝集(++),陰性血清不凝集(一