實驗一-薄層層析板的制備

實驗一薄層層析板的制備實驗目的制備薄層層析板，使葉綠素在層析板上分離顯色。實驗原理薄層層析，常用TLC（Chromatography）表示，又稱薄層色譜，屬于液－固吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時，把吸附層加厚，將樣品點成一條線，則可分離多達500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。薄層吸附色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺和纖維素。其顆粒大小,一般要求直徑為10～40μm。硅膠是無定形多孔性物質，略具酸性，適用于酸性物質的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為：“硅膠H”—不含粘合劑；“硅膠G”—含煅石膏粘合劑；“硅膠HF254”—含熒光物質，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；“硅膠GF254”—既含煅石膏又含熒光劑等類型。粘合劑除上述的煅石膏（半水合硫酸鈣：2CaSO4·H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。實驗材料、器具1、試劑硅膠、4‰的CMC溶液（羧甲基纖維素鈉）2、實驗用具：藥匙、研缽、載玻片、量筒、玻棒四、實驗步驟1、載玻片要求平滑清潔，沒有劃痕，在使用前可用洗滌液或肥皂水洗滌，再用水沖洗干凈。（干凈的標準：水不是呈股流下，而是呈瀑布狀態(tài)流下。）2、與硅膠混合：CMC－Na溶液與硅膠的比例為3:1(3ml：1g)。取CMC－Na溶液倒入研缽中，然后加入硅膠，在研缽中研磨，按一個方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。

3、鋪板：將載玻片置于平臺上，用藥匙舀取糊狀硅膠，均勻地鋪在載玻片表面。鋪板時，可以順著板中間倒，也可以順著某個邊緣倒，也可以用玻璃棒引著溶液平鋪在玻璃板上，倒時也要注意不要引入小氣泡。尤其是載板的四個角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后輕顛幾下薄層板即可。顛好的板，表面看上去要光滑平整，沒有氣孔。薄層板鋪好后一定要放置在平的臺面上，否則難保證板面硅膠的厚度均勻。（3g硅膠大約可鋪7.5×2.5cm載玻片5-6塊）

4、晾干：置水平臺上于室溫下晾干。

5、活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，備用。活化硅膠有利于提高硅膠的吸附性能，同時排除硅膠內部已吸收的水分及其他氣體。通過活化硅膠，主要改變了硅膠內部的微孔結構，使其孔徑的大小及微孔結構的排列得到進一步的改善。但是這樣硅膠的吸附變大，可能會使樣品分離困難下面先介紹一下配置方法：

1.CMC－Na溶液的配置：一般其濃度為0.3～0.5％，根據(jù)自己經驗而定（我習慣用0.4％的）。具體方法如下：先將預用的水加熱至60~70℃，然后加入CMC－Na，邊加邊攪拌，使之溶解，即得。

2.與硅膠混合：CMC－Na溶液與硅膠的比例為3：1。具體方法如下：先將CMC－Na溶液倒入自動攪拌器或研缽中，然后加入硅膠，攪勻即可。若是在研缽中研磨，按一個方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。

3.鋪板：手動或機械。手動鋪出的板的薄厚與所加的混合后的硅膠量有關，而機械鋪出的板的薄厚與機械所選用的鋼板有關，可根據(jù)需要來定。但此過程中最關鍵的是板子邊緣鋪得好壞，手動鋪板一定要將玻璃板邊緣硅膠涂勻（我習慣用兩頭掂法，即板下方的中間墊一物體，兩頭懸空，兩手均勻掂動）。而機械鋪板要注意板與板之間平整性，或者由高到低排列。

4.晾干：自然晾干。

5.活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，取出，放入干燥器中，備用。

這是實驗室和檢驗室薄層層析板常用的制備方法之一，供大家參考！層析英文名稱：chromatography定義1：基于不同物質在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術。當流動相(液體或氣體)流經固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時，各組分沿固定相移動的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。定義2：利用某種類型的固定介質，根據(jù)混合物分子的電荷大小和分子量不同等性質，在流動相和固定相之間進行分離的一種生物化學技術。層析（chromatography）是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力在把微細分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當?shù)囊后w，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（columnchromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（thin-layerchromatography），數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。◆紙層析以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用于分析簡單的混合物時可做單向層析。對于復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替?！舯訉游鲈诓Ａ?、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中，涂在滌綸片基上，當甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）70年代新發(fā)展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當于34個標準大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經硫酰氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫(yī)藥學和環(huán)境科學的研究中發(fā)揮了重要作用?！舴聪鄬游鲈谖綄游鲋?，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。◆同系層析在核酸分析中，將樣品經核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記后，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。于是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用于寡核苷酸的順序分析。紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達到彼