實(shí)驗(yàn)一-薄層層析板的制備

實(shí)驗(yàn)一薄層層析板的制備實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹苽浔訉游霭?，使葉綠素在層析板上分離顯色。實(shí)驗(yàn)原理薄層層析，常用TLC（Chromatography）表示，又稱薄層色譜，屬于液－固吸附色譜。是近年來發(fā)展起來的一種微量、快速而簡單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品（幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。因此又可用來精制樣品。故此法特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物資。薄層吸附色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁、硅膠、硅藻土、聚酰胺和纖維素。其顆粒大小,一般要求直徑為10～40μm。硅膠是無定形多孔性物質(zhì)，略具酸性，適用于酸性物質(zhì)的分離和分析。薄層色譜用的硅膠分為：“硅膠H”—不含粘合劑；“硅膠G”—含煅石膏粘合劑；“硅膠HF254”—含熒光物質(zhì)，可用于波長為254nm紫外光下觀察熒光；“硅膠GF254”—既含煅石膏又含熒光劑等類型。粘合劑除上述的煅石膏（半水合硫酸鈣：2CaSO4·H2O）外，還可用淀粉、羧甲基纖維素鈉。實(shí)驗(yàn)材料、器具1、試劑硅膠、4‰的CMC溶液（羧甲基纖維素鈉）2、實(shí)驗(yàn)用具：藥匙、研缽、載玻片、量筒、玻棒四、實(shí)驗(yàn)步驟1、載玻片要求平滑清潔，沒有劃痕，在使用前可用洗滌液或肥皂水洗滌，再用水沖洗干凈。（干凈的標(biāo)準(zhǔn)：水不是呈股流下，而是呈瀑布狀態(tài)流下。）2、與硅膠混合：CMC－Na溶液與硅膠的比例為3:1(3ml：1g)。取CMC－Na溶液倒入研缽中，然后加入硅膠，在研缽中研磨，按一個(gè)方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。

3、鋪板：將載玻片置于平臺(tái)上，用藥匙舀取糊狀硅膠，均勻地鋪在載玻片表面。鋪板時(shí)，可以順著板中間倒，也可以順著某個(gè)邊緣倒，也可以用玻璃棒引著溶液平鋪在玻璃板上，倒時(shí)也要注意不要引入小氣泡。尤其是載板的四個(gè)角，容易高出玻璃板其他部位，所以要格外注意。后輕顛幾下薄層板即可。顛好的板，表面看上去要光滑平整，沒有氣孔。薄層板鋪好后一定要放置在平的臺(tái)面上，否則難保證板面硅膠的厚度均勻。（3g硅膠大約可鋪7.5×2.5cm載玻片5-6塊）

4、晾干：置水平臺(tái)上于室溫下晾干。

5、活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，備用。活化硅膠有利于提高硅膠的吸附性能，同時(shí)排除硅膠內(nèi)部已吸收的水分及其他氣體。通過活化硅膠，主要改變了硅膠內(nèi)部的微孔結(jié)構(gòu)，使其孔徑的大小及微孔結(jié)構(gòu)的排列得到進(jìn)一步的改善。但是這樣硅膠的吸附變大，可能會(huì)使樣品分離困難下面先介紹一下配置方法：

1.CMC－Na溶液的配置：一般其濃度為0.3～0.5％，根據(jù)自己經(jīng)驗(yàn)而定（我習(xí)慣用0.4％的）。具體方法如下：先將預(yù)用的水加熱至60~70℃，然后加入CMC－Na，邊加邊攪拌，使之溶解，即得。

2.與硅膠混合：CMC－Na溶液與硅膠的比例為3：1。具體方法如下：先將CMC－Na溶液倒入自動(dòng)攪拌器或研缽中，然后加入硅膠，攪勻即可。若是在研缽中研磨，按一個(gè)方向研磨，自下而上，然后自上而下，以趕盡氣泡為佳。

3.鋪板：手動(dòng)或機(jī)械。手動(dòng)鋪出的板的薄厚與所加的混合后的硅膠量有關(guān)，而機(jī)械鋪出的板的薄厚與機(jī)械所選用的鋼板有關(guān)，可根據(jù)需要來定。但此過程中最關(guān)鍵的是板子邊緣鋪得好壞，手動(dòng)鋪板一定要將玻璃板邊緣硅膠涂勻（我習(xí)慣用兩頭掂法，即板下方的中間墊一物體，兩頭懸空，兩手均勻掂動(dòng)）。而機(jī)械鋪板要注意板與板之間平整性，或者由高到低排列。

4.晾干：自然晾干。

5.活化：將晾干的板子在105℃烘箱中干燥30min，取出，放入干燥器中，備用。

這是實(shí)驗(yàn)室和檢驗(yàn)室薄層層析板常用的制備方法之一，供大家參考！層析英文名稱：chromatography定義1：基于不同物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同而將混合組分分離的技術(shù)。當(dāng)流動(dòng)相(液體或氣體)流經(jīng)固定相(多孔的固體或覆蓋在固體支持物上的液體)時(shí)，各組分沿固定相移動(dòng)的速度不同而分離。能用于微量樣品的分析和大量樣品的純化制備。定義2：利用某種類型的固定介質(zhì)，根據(jù)混合物分子的電荷大小和分子量不同等性質(zhì)，在流動(dòng)相和固定相之間進(jìn)行分離的一種生物化學(xué)技術(shù)。層析（chromatography）是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質(zhì)的不同，將多組分混合物進(jìn)行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機(jī)化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質(zhì)在固定相與流動(dòng)相之間不同的分配比例，達(dá)到分離目的的技術(shù)。層析對(duì)生物大分子如蛋白質(zhì)和核酸等復(fù)雜的有機(jī)物的混合物的分離分析有極高的分辨力在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w，也可使用其他物質(zhì)。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（columnchromatogra-phy），在玻璃板上涂上一層薄而均的物質(zhì)作為固定相的稱為薄層層析（thin-layerchromatography），數(shù)分鐘至10余分鐘。檢測記錄系統(tǒng)繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結(jié)果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優(yōu)點(diǎn)。氣相層析也能用于分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置?！艏垖游鲆詾V紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì)，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關(guān)系。紙層析用于分析簡單的混合物時(shí)可做單向?qū)游觥?duì)于復(fù)雜的混合物，可做雙向?qū)游觥?944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創(chuàng)了近代層析的發(fā)展和應(yīng)用的新局面。70年代以后，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替?！舯訉游鲈诓Ａ⒔饘俨蛩芰掀箱伾弦粚蛹s1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等，根據(jù)需要做不同類型的層析。聚酰胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解于濃甲酸中，涂在滌綸片基上，當(dāng)甲酸揮發(fā)后，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時(shí)間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時(shí)間，而且對(duì)層析條件要求嚴(yán)格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時(shí)，分離效果更好。薄層層析一般用于定性分析。也能用于定量分析和制備樣品。◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）70年代新發(fā)展的層析法。其特點(diǎn)是：用高壓輸液泵，壓強(qiáng)最高可達(dá)5000psi（相當(dāng)于34個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細(xì)支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上涂一層1～2微米的二氧化硅，經(jīng)硫酰氯反應(yīng)生成Si—Cl，進(jìn)一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團(tuán)—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團(tuán)—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學(xué)性能穩(wěn)定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達(dá)10-10克水平。但用于制備，可以純化上克的樣品。展層時(shí)間短，一般需幾分鐘到10余分鐘。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適于分析分離不揮發(fā)和極性物質(zhì)。而氣相層析只適用于揮發(fā)性物質(zhì)，兩者互為補(bǔ)充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數(shù)據(jù)處理的積分儀和記錄儀等電子系統(tǒng)，成為一種先進(jìn)的分析儀器，在生物化學(xué)、化學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)的研究中發(fā)揮了重要作用?！舴聪鄬游鲈谖綄游鲋校邩O性物質(zhì)在層析柱上吸附較牢，洗脫時(shí)發(fā)生拖尾現(xiàn)象和保留時(shí)間長的問題。如果在支持物上涂上一層高碳原子的疏水性強(qiáng)的烷烴類，洗脫液用極性強(qiáng)的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強(qiáng)的物質(zhì)不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團(tuán)?！敉祵游鲈诤怂岱治鲋校瑢悠方?jīng)核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標(biāo)記后，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標(biāo)記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標(biāo)記的核苷酸把標(biāo)記過的核苷酸推進(jìn)，使按分子量大小不同把標(biāo)記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達(dá)到分離的目的。于是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結(jié)合曾用于寡核苷酸的順序分析。紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們?cè)谀撤N基質(zhì)中移動(dòng)速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼