乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)感染診斷技術(shù)

2乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)感染診斷技術(shù)4符號(hào)和縮略語(yǔ)bp：堿基對(duì)（Basepair）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（DeoxyribonucleEB：溴化乙錠（EthidiumbroEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminePCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-5.1.1成蟲(chóng)寄生階段，宿主常表現(xiàn)出不同程度的貧血、消瘦、5.1.2感染初期，第三期幼蟲(chóng)穿過(guò)皮膚移行到肺，常引起濕疹、支氣管炎、肺炎和胸膜炎，可因極5.2.1地理分布，呈世界性分布，我國(guó)各地均有反芻動(dòng)物感染乳突類(lèi)圓35.2.2易感動(dòng)物，牛羊等反芻動(dòng)物，幼齡動(dòng)物5.2.3感染途徑，第三期幼蟲(chóng)主要經(jīng)皮膚5.2.4流行季節(jié)，夏季和雨季，圈舍清潔衛(wèi)生不良且潮濕反芻動(dòng)物出現(xiàn)5.1中臨床癥狀且符合5.2的流行特點(diǎn)，可判為疑似乳6.1.1糞便樣品準(zhǔn)備取動(dòng)物新鮮糞便10g，置于燒杯，加入50ml飽和鹽水，調(diào)勻6.1.2顯微鏡檢查用光學(xué)顯微鏡于低倍鏡（10×10）下檢查整個(gè)蓋玻片內(nèi)的視野，觀察是否有蟲(chóng)卵。乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)蟲(chóng)卵大小為（42～60）μm×（25～36）μm，橢圓形，灰白色，卵殼薄而透明，蟲(chóng)卵內(nèi)含幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)盤(pán)曲折疊，形似折疊刀。蟲(chóng)6.1.3.1陽(yáng)性涂片中觀察到1個(gè)及以上的蟲(chóng)卵，且蟲(chóng)卵形態(tài)結(jié)構(gòu)符合附錄A圖1和附錄B中圖7的特6.1.3.2疑似陽(yáng)性觀察到附錄B中圖8和圖14形態(tài)的蟲(chóng)卵，判為疑似陽(yáng)性。判定為疑似陽(yáng)性，需進(jìn)6.1.3.3陰性未出現(xiàn)6.1.3.1和6.1.6.2.1糞便樣品準(zhǔn)備取新鮮糞便20g，塑成半球形，放在平皿中，加少許水（），6.2.2顯微鏡檢查用光學(xué)顯微鏡在低倍鏡（10×10乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)第一期幼蟲(chóng)，體壁透明，無(wú)鞘，長(zhǎng)200～400μm，頭部鈍圓，口腔短，食道呈桿狀、具有前后食道球、食道長(zhǎng)約為體長(zhǎng)的1/4～1/5。第一期幼蟲(chóng)形態(tài)特點(diǎn)參見(jiàn)附6.2.3.2陰性未觀察到幼蟲(chóng)，或觀察到6.3.1成蟲(chóng)采集取待檢動(dòng)物小腸，將腸內(nèi)容物倒入大平皿中，腸黏膜用生理鹽水充分清洗。沖洗物和腸內(nèi)容物用水洗沉淀法（參見(jiàn)附錄E）淘洗，發(fā)6.3.2成蟲(chóng)形態(tài)觀察將蟲(chóng)體用生理鹽水清洗干凈，用解剖針挑至載玻片上，滴加生理鹽水至覆蓋整個(gè)蟲(chóng)體，加蓋玻片。在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察。寄生性乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)雌蟲(chóng)呈毛發(fā)狀，長(zhǎng)4.38mm~4按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取糞便樣品或蟲(chóng)體樣品DNA，用分光光度計(jì)測(cè)量DNA樣品的吸光值A(chǔ)260和在PCR管中配好反應(yīng)體系后，加入待檢樣品基因組DNA，并設(shè)置空白對(duì)照（用和陽(yáng)性對(duì)照（乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)基因組DNA）。反應(yīng)體系為：樣品DNA2μl72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸錠的1.0%瓊脂糖凝膠膠塊中，在1×TAE緩沖液中，5V/cm電泳約20min，凝膠成像7.5.1陽(yáng)性：PCR產(chǎn)物電泳后有一條大小為7.5.2陰性：PCR產(chǎn)物電泳后無(wú)特異性條8.1臨床診斷出現(xiàn)5.1癥狀且符合5.2流行特點(diǎn)，判斷為疑似乳突類(lèi)8.2病原學(xué)診斷出現(xiàn)6.1.3.1或6.2.3.1或6.3.3.1結(jié)果判斷為乳突類(lèi)圓8.3分子生物學(xué)診斷出現(xiàn)7.5.1結(jié)果判斷為乳突類(lèi)圓線蟲(chóng)5678測(cè)微技術(shù)和幼蟲(chóng)的測(cè)量需用測(cè)微器。測(cè)微器由目鏡測(cè)微尺和鏡臺(tái)測(cè)微一清晰的刻度尺。此刻度并不具有絕對(duì)的長(zhǎng)度意義，須通過(guò)鏡臺(tái)9將動(dòng)物小腸內(nèi)容物和腸黏膜清洗物全部轉(zhuǎn)移至大燒杯中（容積在5升以上，也可M為D