高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法（HPLC）

2021/5/91色譜法定義色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術(shù)，將它用于分析化學(xué)并配合適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段，就成為色譜分析法。色譜法中，流動(dòng)相可以是氣體，也可以是液體，由此可分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。固定相既可以是固體，也可以是涂在固體上的液體，由此又可將氣相色譜法和液相色譜法分為氣-液色譜、氣-固色譜、液-固色譜、液-液色譜。2021/5/92目錄一、液相色譜分析法的發(fā)展二、液相色譜分析法的特點(diǎn)三、液相色譜儀四、液相色譜分析法的原理五、高效液相色譜法的主要類(lèi)型及原理六、高效液相色譜分析法的應(yīng)用七、分離數(shù)據(jù)的處理方法八、參考文獻(xiàn)2021/5/93一、液相色譜分析法的發(fā)展20世紀(jì)初：俄國(guó)植物學(xué)家茨維特提出經(jīng)典液相色譜法。經(jīng)典液相色譜法包括柱色譜、薄層色譜、紙色譜。20世紀(jì)60年代末：隨著色譜理論的發(fā)展、高效細(xì)微固定相的開(kāi)發(fā)、高壓恒流泵及高靈敏度檢測(cè)器的應(yīng)用，高效液相色譜法得到了突破性的發(fā)展。

2021/5/94類(lèi)比液柱色譜法和跑道賽跑2021/5/95二、液相色譜分析法的特點(diǎn)在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動(dòng)化。兼具分離和分析功能，可以在線(xiàn)檢測(cè)。2021/5/96高效液相色譜法的突出特點(diǎn)：1）高壓（150－350*105Pa）2）高速3）高效4）高靈敏度（高靈敏度的檢測(cè)器：紫外10-9g，熒光10-11g）2021/5/97三、液相色譜儀（1）2021/5/98三、液相色譜儀（2）2021/5/99四、液相色譜分析法的原理（一）高效液相色譜分析的流程1、由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng)，然后輸出，經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后，導(dǎo)入進(jìn)樣器。2、被測(cè)物由進(jìn)樣器注入，并隨流動(dòng)相通過(guò)色譜柱，在柱上進(jìn)行分離后進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備采集與處理，并記錄色譜圖。3、廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類(lèi)似，不同的是氣相色譜改變溫度，而ＨＰＬＣ改變的是流動(dòng)相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。2021/5/910四、液相色譜分析法的原理（二）高效液相色譜的分離過(guò)程

同其他色譜過(guò)程一樣，ＨＰＬＣ也是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過(guò)程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。2021/5/911流動(dòng)相固定相640000031186279流動(dòng)相固定相分配系數(shù)：物質(zhì)在兩相溶劑中分配平衡時(shí)的比例分配系數(shù)：1分配系數(shù)：332323216161616161688882021/5/912操作過(guò)程圖示

2021/5/913四、液相色譜分析法的原理

不同組分在色譜過(guò)程中的分離情況，首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親和力等是否有差異，這是熱力學(xué)平衡問(wèn)題，也是分離的首要條件。其次，當(dāng)不同組分在色譜柱中運(yùn)動(dòng)時(shí)，譜帶隨柱長(zhǎng)展寬，分離情況與兩相之間的擴(kuò)散系數(shù)、固定相粒度的大小、柱的填充情況以及流動(dòng)相的流速等有關(guān)。所以分離最終效果則是熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)兩方面的綜合效益。2021/5/914五、高效液相色譜法的主要類(lèi)型及原理1、液-液分配色譜2、液-固吸附色譜3、離子交換色譜4、離子對(duì)色譜5、離子色譜6、排阻色譜7、親和色譜(AC)2021/5/9151、液-液分配色譜

固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配；流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2021/5/9162、液-固吸附色譜

基本原理：各組分在固定相吸附劑上競(jìng)爭(zhēng)性吸附與解吸固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。特點(diǎn)：適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；缺點(diǎn)：非線(xiàn)形等溫吸附，常引起峰的拖尾2021/5/917舉例：

苯乙胺類(lèi)藥物中重酒石酸去甲腎上腺素注射液的高效液相色譜測(cè)定法。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.14%更烷基磺酸鈉溶液——甲醇(65:35)，用磷酸調(diào)節(jié)PH值至3.0作為流動(dòng)相；流速為每分鐘1ml；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。理論板數(shù)按重酒石酸去甲腎上腺素峰值計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2021/5/918反相高效液相色譜法即指流動(dòng)相的極性大于固定相極性的色譜方法。在本法中常采用化學(xué)鍵合相作為固定相，流動(dòng)相采用水——甲醇或水——乙腈系統(tǒng)，在反相色譜中，極性強(qiáng)的組分在分離時(shí)先流出柱子，極性弱的組分后流出。因此適合于共存組分極性差異較大的樣品分析。如高效液相色譜測(cè)定硫酸阿托品片的含量。2021/5/919舉例：巴比妥類(lèi)藥物苯巴比妥、苯妥英和卡馬西平均為臨床上常用的抗癲癇藥，其藥物濃度與療效和毒副反應(yīng)密切相關(guān)。臨床上常將三種藥物同時(shí)使用，為提高療效，減少毒副作用與個(gè)體差異，為超劑量中毒診斷、治療與及時(shí)調(diào)整給藥方案提供科學(xué)依據(jù)，臨床上要進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，而高效液相色譜法是最常用的方法之一。

2021/5/920

乙腈(jīng)又名甲基氰，分子式CH3CN，無(wú)色透明液體，密度小于水，約為0.79，能與水、乙醇等有機(jī)溶劑以任意比混溶，易燃，有毒性。2021/5/9213、離子交換色譜

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換樹(shù)脂（固定相）之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)；陽(yáng)離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-固定相：陰離子離子交換樹(shù)脂或陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂；流動(dòng)相：陰離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用堿性水溶液；

陽(yáng)離子離子交換樹(shù)脂作固定相，采用酸性水溶液；應(yīng)用：離子及可離解的化合物、氨基酸、核酸等。2021/5/9224、離子對(duì)色譜

基本原理：離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物，控制溶質(zhì)離子的保留行為使其兩相之間進(jìn)行分配；陰離子分離：常采用烷基銨類(lèi)，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子；陽(yáng)離子分離：常采用烷基磺酸類(lèi)，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X(jué)-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+X-后；在兩相間分配。2021/5/923舉例：維生素類(lèi)藥物的分析

維生素具有脂溶性和水溶性?xún)纱箢?lèi)，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相差較大，在含水介質(zhì)中，又要受到光、空氣、溫度和pH的影響，使測(cè)定結(jié)果不理想。因而，提出用甲醇和水都能溶解的樟腦磺酸，作為離子對(duì)試劑，以二巰基丙烷磺酸鈉0.125g/ml作為抗氧化劑，能使被測(cè)樣品處于穩(wěn)定的初始狀態(tài)，結(jié)果更為可靠。

2021/5/924反相離子對(duì)色譜

是分離有機(jī)離子的有效方法，離子對(duì)試劑和其他添加劑的選用規(guī)則：1.樣品中含有—COOH,—SO3H基團(tuán)時(shí)，選用的離子對(duì)試劑應(yīng)是帶正電荷的有機(jī)銨鹽，以增加樣品陰離子在反響色偶中的保留值，選用的流動(dòng)相一般是甲醇/水；2.除了加入離子對(duì)試劑，還要加入磷酸鹽或者其他緩沖液，以控制流動(dòng)相的酸度；3.樣品中含有—NH2和—NH基團(tuán)或其他陽(yáng)離子時(shí)，選用的離子對(duì)試劑應(yīng)是烷基磺酸鹽或硫酸鹽；4.樣品同時(shí)含有—NH2，—COOH,—SO3H等不同性質(zhì)的基團(tuán)時(shí)則以上規(guī)則選用的離子對(duì)試劑和添加劑都合理。2021/5/925舉例：芳酸及其酯類(lèi)藥物分析合成氨基水楊酸鈉時(shí)，以間氨基酚為原料的生產(chǎn)路線(xiàn)較為普遍，因此在成品中可能含有未完全反應(yīng)的間氨基酚。USP(24)采用離子對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)間氨基酚的限量。色譜條件：填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18,10um)；色譜柱為250mmX46mm；流動(dòng)相為磷酸二氫鈉液(0.05mol/L)—磷酸氫二鈉液(0.05mol/L)—甲醇(含氫氧化四丁基銨1.9g)(425:425:100)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；流速為1.5ml/min。

2021/5/9265、離子色譜

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。2021/5/927

陽(yáng)離子交換：R—H+Na+OH-

＝R—Na+H2OR—H+Na+Br-

＝R—Na+H+Br-陰離子交換：R—OH+Na+Br-＝R—Br+Na+OH-使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱(chēng)為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。2021/5/928雙柱型離子色譜裝置圖

離子色譜連續(xù)抑制裝置圖2021/5/9296、空間排阻色譜

原理：又稱(chēng)凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過(guò)，出峰最慢；中等分子只能通過(guò)部分凝膠空隙，中速通過(guò)；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在103-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2021/5/9307、親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)

。這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫2021/5/9318、薄層層析色譜是色譜法的一種，是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固—液吸附色譜，它集柱色譜和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于少量樣品(幾微克，甚至0.01微克)的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，因此又可用來(lái)精制樣品。此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)均勻涂鋪在平面板(如玻璃板、塑料片、金屬板等)上，形成薄層(常用厚度為0.25毫米左右)后，在此薄層上進(jìn)行層析分離的方法。此法在雜環(huán)類(lèi)藥物的鑒別實(shí)驗(yàn)中有廣泛應(yīng)用。

2021/5/932流動(dòng)相選擇該注意的幾點(diǎn)問(wèn)題1、盡量使用高純度試劑做流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期積聚而損壞色譜柱；2、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生相互作用而使柱效下降或損壞柱子；3、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積；4、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)器的需求。2021/5/933

液相色譜分離類(lèi)型參考表樣品相對(duì)分子量>2000排阻色譜溶于水水為流動(dòng)相不溶于水非水流動(dòng)相具有親和性親和色譜小結(jié)：分離類(lèi)型選擇相對(duì)分子量<2000不溶于水同系物分配色譜異構(gòu)體吸附色譜溶于水不離解反相液液色譜可離解陰離子交換色譜陽(yáng)離子交換色譜離子對(duì)色譜離子色譜2021/5/934六、高效液相色譜分析法的應(yīng)用

由于高效液相色譜具有高速、高效、高靈敏度等特點(diǎn)，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家學(xué)者將高效液相色譜技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物（主要是中藥）、農(nóng)藥和食品等行業(yè)中，取得了明顯的效果。下面從實(shí)例出發(fā)，分析高效液相色譜分析方法在一些方面的應(yīng)用：2021/5/9351、高效制備液相色譜在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用

天然產(chǎn)物（主要是中藥）種類(lèi)繁多,所含化學(xué)成分種類(lèi)豐富,且有不少結(jié)構(gòu)相似而含量高低不一,采用常規(guī)方法難以進(jìn)行分離、精制。而HLPC的高靈敏性和高效性使其能有效地分離純化某些天然產(chǎn)物中的有效成分。如表2列出的便是其中幾種。已有文獻(xiàn)對(duì)利用HLPC分離一些天然產(chǎn)物進(jìn)行了報(bào)道，如黃酮類(lèi)化合物（如下表所示）、苷類(lèi)化合物、有機(jī)酸類(lèi)化合物和生物堿類(lèi)化合物等等。2021/5/9362021/5/9372、液相色譜技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

液相色譜法是一種經(jīng)典的分析方法由于其具有操作簡(jiǎn)便分析速度快分離效能高靈敏度高以及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)目前農(nóng)藥殘留物檢測(cè)70%采用液相色譜法來(lái)進(jìn)行使用液相色譜法多種農(nóng)藥可以一次進(jìn)樣得到完全的分離定性和定量再配置高性能的檢測(cè)器使分析速度更快結(jié)果更可靠。在王志強(qiáng)、錢(qián)允輝、張琰論文中，試驗(yàn)測(cè)定稻米中吡蟲(chóng)啉農(nóng)藥殘留，樣品經(jīng)高速勻漿提取、florisil柱凈化，在269nm波長(zhǎng)下，采用高效液相色譜(HPLC)法分離測(cè)定。結(jié)果表明，吡蟲(chóng)啉回收率為81.90％~87.80％相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.24%~4.51%，方法最低檢出限為0.0016mg/kg，該方法的準(zhǔn)確性、精確性以及靈敏度均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求。2021/5/9383、高效液相色譜在食品行業(yè)中的應(yīng)用

高效液相色譜法在食品化學(xué)分析方面的應(yīng)用已較為普及，林春曉等用HPLC對(duì)保健食品中的雌二醇分離測(cè)定。王美麗、陳海婷等建立了利用HPLC檢測(cè)肉制食品中5種鄰苯二甲酸酯類(lèi)增塑劑(PAEs)含量的方法。樣品用正己烷提取，C18柱分離，柱溫35℃，乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)226nm。5種PAEs分離特異性好，在0.02~10微克/毫升之間均具有較好的線(xiàn)性關(guān)系，檢出限在4.4~13.8ng/mL之間，高、中、低3水平的回收率均在79.5%~102.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.1%~14%之間。該方法適用于肉制食品中鄰苯二甲酸酯類(lèi)的檢測(cè)。2021/5/939高效液相色譜法測(cè)定乳制品中三聚氰胺的含量

三聚氰胺(melamine)是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，為白色或無(wú)色結(jié)晶,通常用于塑料制品中合成樹(shù)脂的生產(chǎn)。近年來(lái)，一些不法廠(chǎng)商將三聚氰胺添加到奶粉中，以增加蛋白質(zhì)含量。2008年9月,震驚中外的“三鹿嬰幼兒奶粉事件”暴露出乳制品行業(yè)的“潛規(guī)則”，國(guó)內(nèi)一些知名乳品品牌也被檢出其產(chǎn)品中含三聚氰胺。因此，如何快速、準(zhǔn)確分析乳制品中的三聚氰胺成為多方關(guān)關(guān)注的問(wèn)題。胡陽(yáng)、倪揮等的論文報(bào)道了利用高效液相色譜分析方法測(cè)定三聚氰胺的含量。（具體實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)論文）2021/5/940

內(nèi)標(biāo)法是色譜分析中一種比較準(zhǔn)確的定量方法，尤其在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照時(shí)，此方法更顯其優(yōu)越性。內(nèi)標(biāo)法是將一定重量的純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，加到一定量的被分析樣品混合物中，然后對(duì)含有內(nèi)標(biāo)物的樣品進(jìn)行色譜分析，分別測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積（或峰高）及相對(duì)校正因子，按公式即可求出被測(cè)組分在樣品中的百分含量：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱(chēng)（量）取對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測(cè)定用的對(duì)照溶液。取一定量進(jìn)樣，記錄色譜圖。八、分離數(shù)據(jù)的處理方法2021/5/941

用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式算出校正因子f=(As/ms)/(Ar/mr)其中As和Ar分別為內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的峰面積或峰高，ms和mr分別為加入內(nèi)標(biāo)物和對(duì)照品的量。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)組分溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖，再根據(jù)含內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)組分溶液色譜峰響應(yīng)值，計(jì)算含量mi=f×Ai/(As/ms)其中Ai和As分別為供試品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高，ms為加入內(nèi)標(biāo)物的量。必要時(shí)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)、取樣量和標(biāo)示量折算成為標(biāo)示量的百分含量，或根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量折算成百分含量。2021/5/942注意事項(xiàng)

采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說(shuō)，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化