QB-T5483-2020化學(xué)消毒劑與殺菌劑殺真菌活性試驗(yàn)方法和要求

殺真菌活性試驗(yàn)方法和要求中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部發(fā)布1化學(xué)消毒劑與殺菌劑殺真菌活性試驗(yàn)方法和要求SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測(cè)試實(shí)用指南2 6.2.6洗液(用于膜過(guò)濾法)37設(shè)備和玻璃儀器使用下列方法的一種，對(duì)所有的玻璃儀器和能接觸到培養(yǎng)基和試劑或樣品的部分設(shè)備(除無(wú)菌的) ——干熱滅菌法，用干熱滅菌器。對(duì)于濕熱滅菌法，高壓滅菌鍋在(121#3)℃下最短保留時(shí)間為15min。對(duì)于干熱滅菌法，干熱滅菌器在(180±5)℃下最短保留時(shí)間為30min,或在(170±5)℃下最短保留時(shí)間為1h,或在(160±5)C下最短保留時(shí)間為2h7.2.2水浴鍋應(yīng)控制在(20±1)℃、(45±1)℃(用以保持溶化的MEA可傾注于平皿)以及增加的試驗(yàn)溫度應(yīng)控制在(30±1)℃。(20±1)℃下，精度為0.1pH。7.2.5秒表7.2.6渦流攪拌器由與待過(guò)濾的物質(zhì)相符的材料組成，應(yīng)配備容積不小于50mL的接液器。直徑為47mm～50mm,應(yīng)提供穩(wěn)定的過(guò)濾流量，在20s~40s得到100mL過(guò)濾液，使微生物均勻分布在膜上。7.2.8冰箱應(yīng)控制在2℃~8℃。0.1mL、1mL和10mL,或帶有刻7.2.10培養(yǎng)皿7.2.12容器8.1試驗(yàn)菌懸液4制備試驗(yàn)菌及其母代培養(yǎng)物，應(yīng)符合微生物保藏傳代要求。8.1.3試驗(yàn)菌的工作培養(yǎng)物8.1.3.1白色念珠菌(酵母菌)為制備白色念珠菌試驗(yàn)菌的工作培養(yǎng)物，將源于母代的培養(yǎng)物接種于MEA斜面或平皿，并培養(yǎng)得到第1代培養(yǎng)物。42h~48h后，用同樣的方法由第1代培養(yǎng)物制備第2代培養(yǎng)物，并培養(yǎng)42h~48h。以同樣的方法，由第2代培養(yǎng)物制備第3代培養(yǎng)物。第2代和第3代培養(yǎng)物為工作培養(yǎng)物。若在特定時(shí)間未得到第2代培養(yǎng)物，在隨后的傳代中可采用72h的培養(yǎng)物，即將第1代培養(yǎng)物保8.1.3.2黑曲霉菌(霉菌)僅使用將源于母代培養(yǎng)物接種于MEA斜面或平皿上培養(yǎng)9d~11d的第1代培養(yǎng)物。8.1.3.3其他增加的菌種其他增加的酵母菌和霉菌按各自要求進(jìn)行培養(yǎng)使用。8.1.4試驗(yàn)菌懸液(N)接種環(huán)在錐形瓶壁與液面接觸處涂扶以便移出菌，使真菌分散在稀釋劑中。用機(jī)保持懸液恒溫于試驗(yàn)溫度(θ±1)℃的水浴鍋中，并于2h內(nèi)使用。用分光光度計(jì)調(diào)整細(xì)菌數(shù)(波長(zhǎng)約620nm,口徑長(zhǎng)為10mm的比色管)。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)每一種試驗(yàn)菌進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn)，從而得到適合的光密度值，一般在0為便于計(jì)數(shù)，用稀釋劑制備10*和106試驗(yàn)菌懸液稀釋液，混勻。分取每種稀釋液1.0mL的樣品，一式兩份，采用傾注平板法或者涂布平板法進(jìn)行培養(yǎng)。使用涂布平板法時(shí)，將每份1.0mL樣品涂布于MEA平板(至少兩個(gè))表面培養(yǎng)與計(jì)數(shù)。用玻璃棒或刮刀取培養(yǎng)的黑曲霉菌到含適量玻璃珠的100mL錐形瓶(內(nèi)含0.05%聚山梨醇酯80用400倍顯微鏡觀察菌液中是否有菌絲片段和發(fā)芽的孢子，若出現(xiàn)發(fā)芽孢子，則此菌懸液不可用。若僅出現(xiàn)菌絲，轉(zhuǎn)移懸液到離心管中，在離心機(jī)中以2000r/min離心20min,用稀釋劑至少洗滌離心兩次，若仍有菌絲，則重復(fù)洗滌至無(wú)菌絲。保持懸液恒溫于試驗(yàn)溫度的水浴鍋中，并于4h內(nèi)使用。該菌懸液可以在冰箱中冷藏保存2d,再次使8.1.5驗(yàn)證菌懸液(Nv)為便于計(jì)數(shù)，用稀釋劑制備10-1稀釋液，混5記錄每一平皿的確切菌落數(shù)，當(dāng)霉菌大于165時(shí)，記錄>165,酵母菌大于330時(shí)，則記錄>330,確定Vc值。a)作用溫度(以℃表示):——必需測(cè)試溫度為20℃; b)作用時(shí)間(以min表示): 69.2.2試驗(yàn)步驟使用涂布平板法時(shí)，將每份1.0mL樣控制在(20±1)℃水浴內(nèi)5min±10s。恰在作用時(shí)間結(jié)束前，立即混勻。7記錄每一平皿的確切菌落數(shù)，但若霉菌數(shù)多于165,記錄>165,酵母菌計(jì)數(shù)多于3309.3.2殺真菌或酵母菌濃度試驗(yàn)(Na)8管移至(20±1)℃水浴內(nèi)5min±10s。加入1.0mL驗(yàn)證菌懸液，計(jì)時(shí)，混勻。將試管移至(20±1)℃記錄每一平皿的確切菌落數(shù)，但若霉菌數(shù)高于55,記錄>55,酵母菌計(jì)數(shù)高于165,則記錄>165,有10%的偏差，因此限制范圍霉菌在14～165之間，酵母菌在14～330之間。至于膜上，最高限制是不同的：霉菌在50,酵母菌在150,即，允許有10%的偏差：霉菌在55,酵母菌在165。n?—較低稀釋度(10-5)的Vc值的個(gè)數(shù)；12較高稀釋度(10-6)的Vc值的個(gè)數(shù)；9910-5與較低稀釋度相應(yīng)的稀釋因子。將計(jì)算的結(jié)果采用四舍六入五留雙，修約至兩位有效數(shù)字，用科學(xué)計(jì)數(shù)法表達(dá)結(jié)果。用公式(2)計(jì)算Na:式中：Na每毫升試驗(yàn)混合物在作用時(shí)間結(jié)束后，以及中和或膜過(guò)濾之前每毫升所含的菌落數(shù)，單CVe值總和，單位為CFU;n——Vc值個(gè)數(shù)。若相同條件下的Ve值中有一個(gè)或兩個(gè)低于最低限制或高于最高限制，以“少于”或“多于”表達(dá)其結(jié)果。a)平行V.值：<14,16b)平行V.值(傾注平板黑曲霉菌):>165,>165c)平行V.值(膜過(guò)濾黑曲霉菌):40,>55d)平行V.值(每含1.0mL樣液的兩個(gè)涂布平板白色念珠菌)10.1.4Nv與Noo的計(jì)算用公式(3)(4)計(jì)算No與No:式中：N驗(yàn)證菌懸液每毫升所含菌落數(shù)，單位為CFU/mL;No混合物A、BCVe值總和，單位為CFU;2Vc值個(gè)數(shù)。A、B與C是試驗(yàn)的條件控制(A),中和劑控制或過(guò)濾控制(B),以及方法證實(shí)(C),在作用時(shí)間用公式(5)計(jì)算A、B與C: (5)A每毫升條件控制試驗(yàn)混合物所含菌落數(shù)，單位為CFU/mL;B——每毫升中和或過(guò)濾控制試驗(yàn)混合物所含菌落數(shù)，單位為CFU/mL;C——每毫升方法證實(shí)試驗(yàn)混合物所含菌落數(shù)，單位為CFU/mL;CVc值總和，單位為CFU;10.2方法學(xué)的證實(shí)10.2.1加權(quán)平均數(shù)的控制通過(guò)兩個(gè)連續(xù)稀釋度的加權(quán)平均數(shù)計(jì)算結(jié)果，兩個(gè)結(jié)果的平均值之商不應(yīng)高于15,且不應(yīng)低于5。將低于最低限制的結(jié)果作為最低限制數(shù)(14CFU),將高于各個(gè)最高限制的結(jié)果作為最高限制數(shù)。N:10-6稀釋度：168+215CFU/mL,10-7稀釋度：20+<14CFU/mL;(168+215)/(20+14)=383/34=11,其商在5與10.2.2基本范圍——加權(quán)平均數(shù)的控制：商不低于5,且不大于15。10.3結(jié)果10.3.1減少量對(duì)于每種試驗(yàn)菌，記錄試驗(yàn)菌懸液的菌落數(shù)N,以及試驗(yàn)后的Na菌落數(shù)。在每一產(chǎn)品濃度及每一試驗(yàn)條件下，用公式(6)分別計(jì)算并記錄對(duì)數(shù)值減少量(1g):稀釋-中和法與膜過(guò)濾法中的控制與證實(shí)試驗(yàn)，記錄N10.3.2活性與非活性試樣溶液的控制每次試驗(yàn)，至少有一個(gè)濃度可減少4個(gè)對(duì)數(shù)值或更多，以及至少有一個(gè)濃度減少量應(yīng)少于4個(gè)對(duì)數(shù)10.3.3.1殺真菌濃度對(duì)于每種試驗(yàn)菌，記錄通過(guò)試驗(yàn)(1gR≥4)的產(chǎn)品的最低濃度。(該濃度對(duì)于樣品來(lái)說(shuō)，在所選試10.3.3.2殺酵母菌濃度 A.4.1稀釋-中和法物、中和劑、硬水)恒溫至試驗(yàn)溫度(θ±1)℃。取兩份1.0mL樣品混合物樣液，轉(zhuǎn)移至不同的培養(yǎng)皿內(nèi)。加入15mL～20mL冷卻至(45±1)℃的3×103CFU/mL菌懸液1.0mL。加菌懸液時(shí)就開(kāi)始計(jì)時(shí)，混勻，于(20±1)℃水浴鍋內(nèi)保持(30±(45±1)℃的MEA,于(30±1)℃下培養(yǎng)平皿24h。棄去不可計(jì)數(shù)的平皿，確定每一平皿的菌落形物、洗液、硬水)恒溫至試驗(yàn)溫度(θ±1)℃。同的MEA平板表面，當(dāng)將薄膜置于MEA平板上時(shí)，應(yīng)避免將空氣引入薄膜和瓊脂表面之間。于 8.0mL,混勻。于(θ±1)℃水浴鍋內(nèi)保持1±10s后立即混勻，分別吸取兩份1.0mL的樣品混合物 0.25mol/L磷酸鹽緩沖液： ——含30g/L的吐溫80;4g/L的月桂基硫酸鈉；3g/L的卵磷脂的0.0025mol/L磷酸鹽緩沖液；——含5%(體積分?jǐn)?shù))的新鮮蛋黃；40g/L的吐溫80的0.0025mol/L磷酸鹽緩沖液； 含7%(體積分?jǐn)?shù))的脂肪醇環(huán)氧乙烷縮合物；20g/L的卵磷脂；4%(體積分?jǐn)?shù))的吐溫80 含0.075%(體積分?jǐn)?shù))碘美拉酸(用NaOH調(diào)pH