生物化學(xué)：第三章 核酸化學(xué)

生物化學(xué)第三章核酸化學(xué)第一節(jié)概述一、核酸的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展1868年核酸最早分離自外科繃帶膿細(xì)胞的細(xì)胞核，當(dāng)時發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)含磷量，并且含有很強(qiáng)的酸性，故得名核酸。1909年其組成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，后來在X射線衍射技術(shù)支持下建立雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(1944)核酸（nucleicacid）是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。核酸的分類及分布

存在于細(xì)胞核和線粒體內(nèi)。存在于胞核、胞液和線粒體。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個體的遺傳型(genotype)。參與遺傳信息的復(fù)制與表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。DNARNA蛋白質(zhì)復(fù)制復(fù)制轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄翻譯遺傳信息傳遞的中心法則第二節(jié)核酸的組成核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解核酸的化學(xué)組成除含C、H、O、N外，還含有較多的磷（含磷量在9－10％）核酸的基本組成單位是核苷酸

(nucleotide)。堿基戊糖磷酸核苷酸核苷核酸DNA的基本組成單位是脫氧核糖核苷酸。RNA的基本組成單位是核糖核苷酸。一、戊糖（構(gòu)成RNA）核糖(ribose)（構(gòu)成DNA）脫氧核糖(deoxyribose)嘌呤

嘧啶

堿基腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（U）DNA、RNA均有DNA有RNA有每種核酸都含有四種堿基。二、堿基嘌呤(purine)腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)三、核苷（nucleoside)

核苷是核糖與堿基(嘌呤堿或嘧啶堿)結(jié)合物。問題：核糖是如何與堿基形成核苷的？嘌呤核苷是嘌呤的第9位N與核糖或脫氧核糖第1′位碳連接；嘧啶核苷是嘧啶的的第1位N與核糖或脫氧核糖第1′位碳連接；堿基和核糖（或脫氧核糖）通過糖苷鍵連接形成核苷(nucleoside)

（或脫氧核苷）。核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脫氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP

核苷（脫氧核苷）和磷酸以酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。

四、核苷酸

多磷酸核苷酸：(能量載體）

NMP，NDP，NTP

環(huán)化核苷酸:cAMP，cGMP（調(diào)節(jié)與信號分子）八種核苷酸如下表所示

M-單(D-二、T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某苷(一磷)酸，DNA在某前加脫氧兩字。 例如：AMP稱腺苷一磷酸(或腺苷酸），

dAMP稱為脫氧腺苷一磷酸（脫氧腺苷酸）。稀有核苷酸與上類似；

DNA與RNA的組成區(qū)別核酸堿基戊糖DNAA、G、C、T脫氧核糖RNAA、G、C、U核糖第三節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)一、核酸的一級結(jié)構(gòu)

核酸的一級結(jié)構(gòu)是指核苷酸的組成及排列順序（即堿基序列）。5′端3′端核苷酸之間以3

,5

-磷酸二酯鍵連接形成多核苷酸鏈，即核酸。在鏈的一端的一個戊糖的3′位上OH是游離，另一端的戊糖其5′位上連有一個磷酸基團(tuán)呈單磷酸酯狀態(tài)，這兩個末端分別稱為3′末端及5′末端。CGA3′端DNA一級結(jié)構(gòu)的簡寫形式核苷酸順序又稱堿基順序，是蛋白質(zhì)與RNA結(jié)構(gòu)的生物語言。戊糖3`-OH5`-磷酸PA核苷酸5`3`首端末端PPPPPP

AGCTGCOH書寫方法二、DNA的二級結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)RosalindFranklin1962年，Crick、Watson和Wilkins獲得諾貝爾獎。（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景

堿基組成分析Chargaff規(guī)則：[A]=

[T][G]=

[C]

堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對較合理DNA的X-線衍射圖譜分析（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)1.兩條鏈反向平行，圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋(doublehelix)。螺旋直徑2nm，表面有大溝和小溝。2.磷酸-脫氧核糖骨架位于螺旋外側(cè)，堿基垂直于螺旋軸而伸入內(nèi)側(cè)。每圈螺旋含10個堿基對

(bp)，螺距為3.4nm。堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行3.兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，A對T有兩個氫鍵，C對G有三個氫鍵，這種A-T、C-G配對的規(guī)律，稱為堿基互補(bǔ)規(guī)則。4.維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向為氫鍵，縱向為堿基間的堆積力。DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性Z型DNAB型DNAA型DNA二、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及其在染色質(zhì)中的組裝（自學(xué)內(nèi)容）（一）DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix

或supercoil)DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負(fù)超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。（三）DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是核小體(nucleosome)。核小體的組成DNA：約200bp組蛋白：H1H2A，H2BH3H4串珠狀核小體結(jié)構(gòu)串珠狀核小體DNA雙螺旋片段染色質(zhì)纖維伸展形染色質(zhì)片段密集形染色質(zhì)片段整個染色體DNA的功能DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的具有遺傳信息的核苷酸序列，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。RNA（核糖核酸）∶主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，與蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)RibosomalRNAs(rRNA，核糖體RNA)占80%以上：與蛋白質(zhì)構(gòu)成核糖體，是合成蛋白質(zhì)的場所MessengerRNAs(mRNA，信使RNA)

占5%：合成蛋白質(zhì)的模板TransferRNAs(tRNA

，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA)占15%：在蛋白質(zhì)合成中運(yùn)輸氨基酸三、RNA的結(jié)構(gòu)RNA分子的基本結(jié)構(gòu)是一條線性的多核苷酸鏈，由四種核糖核苷酸以3’，5’-磷酸二酯鍵連接而成。（一）、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能2、其結(jié)構(gòu)模式為∶

5’-帽子-5’非編碼區(qū)-編碼區(qū)-3’非編碼區(qū)-3’多聚A1、真核mRNA鏈翻譯產(chǎn)生一條多肽鏈。5’-帽子結(jié)構(gòu)(1)

大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個7-甲基鳥苷，經(jīng)焦磷酸與mRNA的5‘-末端核苷酸相連，形成5’，5’

-三磷酸酯鍵。同時第一個核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。*mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(2)大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。多聚腺苷酸（多聚A)的尾的作用可能是延長mRNA的壽命，從而可以增加蛋白質(zhì)合成的數(shù)量。此外，還可能有助于mRNA穿過核膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)執(zhí)行其模板功能.mRNA核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)位mRNA的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能mRNA的功能：作為蛋白質(zhì)合成的模板。*

tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含稀有堿基較多

3′末端為—CCA-OH5′末端大多數(shù)為G

由70-90個核苷酸組成(二）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的結(jié)構(gòu)與功能

稀有堿基*tRNA的二級結(jié)構(gòu)——三葉草形氨基酸臂額外環(huán)*tRNA的三級結(jié)構(gòu)——倒L形*tRNA的功能活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。*rRNA的結(jié)構(gòu)（三）、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能*rRNA的功能參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。核糖體的組成原核生物真核生物小亞基30S40SrRNA16S18S蛋白質(zhì)21種33種大亞基50S60SrRNA23S5S28S5.8S5S蛋白質(zhì)33種49種核糖體70S80S第四節(jié)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、一般理化性質(zhì)∶

核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性；

DNA是線性高分子，粘度極大 均為極性化合物，難溶于有機(jī)溶劑。嘌呤堿和嘧啶堿均含有共軛雙鍵，因此，核苷、核苷酸、DNA和RNA在240～290nm范圍內(nèi)均有紫外吸收。最大吸收峰在260nm左右。二、紫外吸收性質(zhì)∶核酸的紫外吸收性質(zhì)可以用于鑒定DNA和RNA的純度，常用A260/A280比值來判斷。 純DNA∶A260/A280=1.8

純RNA∶A260/A280=2.0若樣品的蛋白質(zhì)含量增加，A260/A280比值怎樣變化？增色效應(yīng)(hyperchromiceffect)∶當(dāng)核酸變性或降解時，其紫外吸收顯著增強(qiáng)，這就是核酸的增色效應(yīng)。減色效應(yīng)(hypochromiceffect)∶當(dāng)變性的核酸在一定條件下恢復(fù)其原有的性質(zhì)時，其紫外吸收的強(qiáng)度又可恢復(fù)到原有的水平，這種現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)。三、核酸和核苷酸的兩性解離∶

在核酸和核苷酸分子中，既含有可以給出H+的磷酸基團(tuán)，又含有可以得到H+的堿性基團(tuán)(堿基上的-N=，如嘌呤的N1和N7，胞嘧啶的N3)，所以核酸和核苷酸是兩性化合物，有等電點(diǎn)。5′－脫氧腺苷一磷酸四、核酸的變性、復(fù)性和分子雜交1、變性∶(1)概念∶

核酸變性是指核酸分子中雙螺旋區(qū)域的堿基對之間的氫鍵受某些理化因素的作用而破壞，變成單鏈的過程。

核酸變性不涉及共價鍵的斷裂，所以變性后相對分子量不變，但其理化性質(zhì)和生物功能都會發(fā)生變化，最重要的表現(xiàn)為∶

溶液粘度降低 沉降速率增加 紫外吸收顯著增強(qiáng)∶DNA可增加20-25% RNA可增加10%左右。 生物功能喪失或減弱。DNA變性的本質(zhì)：雙鏈間氫鍵的斷裂(2)引起核酸變性的因素∶

高溫 極端pH(pH>10或pH<4)

變性劑(如∶尿素等)(3)DNA的變性溫度(Tm):

DNA的變性不是隨溫度升高而逐步發(fā)生的，而是當(dāng)溫度達(dá)到某一數(shù)值時，在很窄的溫度范圍內(nèi)，變性突然發(fā)生并迅速完成，就象晶體物質(zhì)達(dá)到熔點(diǎn)時突然融化一樣，這一溫度就稱為DNA的變性溫度，也稱為DNA的熔點(diǎn)，用Tm來表示。 實(shí)際上，Tm是增色效應(yīng)達(dá)到最大值的50%時的溫度。也就是說，DNA溶液的溫度達(dá)到Tm時，將有50%的DNA雙鏈處于解鏈狀態(tài)。

DNA的Tm一般為70～85℃。

Tm隨DNA分子中G-C堿基對含量的增加而升高。它也與溶液的離子強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，離子強(qiáng)度低，Tm值小。2、DNA的復(fù)性∶

變性的DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的互補(bǔ)單鏈又可以恢復(fù)堿基配對，重新成為雙螺旋，這個過程稱為DNA的復(fù)性（DNArenaturation）。

復(fù)性后的DNA的某些理化性質(zhì)和生物活性也可以得到部分或全部恢復(fù)。如∶減色效應(yīng)。退火（annealing）:

即DNA由單鏈復(fù)性變成雙鏈結(jié)構(gòu)的過程。來源相同的DNA單鏈經(jīng)退火后完全恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)，不同源DNA之間、DNA和RNA之間退火后形成雜交分子。

一定條件下，去除變性因素后，核酸恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)及生物活性的現(xiàn)象高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗退火（annealing）(1)降溫速度。若熱變性的DNA從高溫(Tm)迅速冷卻至低溫(4℃以下)，則不能復(fù)性，此過程稱為淬火。(2)DNA溶液的濃度越大，互補(bǔ)DNA鏈片段碰撞機(jī)會越多容易發(fā)生復(fù)性。(3)DNA片段越大，DNA內(nèi)部的順序越復(fù)雜，擴(kuò)散速度也越慢，互補(bǔ)鏈的相遇機(jī)會也越小，復(fù)性也越難。與復(fù)性有關(guān)的因素∶3、分子雜交（Hybridization）

不同來源的變性DNA，若彼此之間有部分互補(bǔ)的核苷酸順序，當(dāng)它們在同一溶液中進(jìn)行熱變性和退火處理時，分子間部分配對成雙鏈，這個過程稱為分子雜交。將膠浸泡在堿溶液中使DNA進(jìn)行變性，然后將變性DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上〔硝酸纖維素膜只吸附變性DNA)，在80℃烤4－6小時，使DNA牢固地吸附在硝酸纖維素膜上。然后與