(高清版)GBT 40257-2021 桃拉綜合征診斷規(guī)程 RT-PCR檢測法

國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40257—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本文件由全國水產(chǎn)標準化技術(shù)委員會(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所、全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站。1GB/T40257—2021桃拉綜合征診斷規(guī)程RT-PCR檢測法本文件規(guī)定了桃拉綜合征診斷規(guī)程中普遍適用的核酸檢測技術(shù)的要求，針對桃拉綜合征病毒(taurasyndromevirus,TSV),給出了RT-PCR檢測法所需試劑或材料、儀器設(shè)備、樣品、試驗步驟和本文件適用于對蝦各生活期樣品中TSV帶毒情況的定性檢測，以進行桃拉綜合征的流行病學調(diào)2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文GB/T28630.4—2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第4部分：組織病理學診斷法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。bp:堿基對(basepair)cDNA:互補脫氧核糖核酸(complementaryDNA)DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB:溴化乙錠(ethidiumbromide)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒(moloney-murineleukeminvirus)PCR:聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(ribonucleicacid)RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction)Taq:水生棲熱菌(thermusaquaticus)Tris:三羥甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane)TSV:桃拉綜合征病毒(taurasyndromevirus)2GB/T40257—20215試劑或材料5.1除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水。5.2DEPC處理水：生化試劑。5.3TRIzolTM總RNA提取試劑：生化試劑，或其他等效產(chǎn)品。5.5異丙醇。5.6無水乙醇。5.7無RNA酶的75%乙醇：按附錄A中A.1配制。5.11dNTPs(各10mmol/L):生化試劑，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各10mmol/L的混合物，—20℃保存，用于逆轉(zhuǎn)錄。5.12dNTPs(各2.5mmol/L):生化試劑，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，—20℃保存，用于PCR。5.16引物9992F(10μmol/L):5'-AAG-TAG-ACA-GCC-GCG-CTT-3'。5.17引物9195R(10mol/L):5'-TCA-ATG-AGA-GCT-TGG-TCC-3'。5.18RT-PCR檢測陽性對照：已知受TSV感染且RT-PCR結(jié)果顯示陽性的對蝦組織樣品，-80℃保存。5.19RT-PCR檢測陰性對照：已知未受TSV感染且RT-PCR結(jié)果顯示陰性的對蝦組織樣品，-80℃保存。5.20RT-PCR檢測空白對照：DEPC處理水。5.221×電泳緩沖液：按A.3配制。5.23瓊脂糖：生化試劑。5.24DNA分子量標準：生化試劑。5.256×載樣緩沖液：生化試劑。5.2610mg/mLEB貯存液：按A.46儀器設(shè)備6.1PCR儀。6.2電泳儀。6.3水平電泳槽。6.4紫外觀察儀或凝膠成像儀。6.5高速冷凍離心機。6.6水浴鍋或金屬浴。6.7普通冰箱。3GB/T40257—20217.3.1對蝦仔蝦取完整個體；幼蝦至成蝦階段取去除眼柄的頭胸甲(淋巴器官、鰓絲、觸角腺等)和8.1RNA的提取4℃,12000r/min離心5min。取上清至新的無RNA酶離心管中。提取過程同時設(shè)置陽性對照和陰8.1.54℃,12000r/min離心10min,棄上清。8.1.6加入1mL無RNA酶的75%乙醇(4℃預冷),上下顛倒洗滌沉淀，再于4℃,7000r/min離心8.1.7加入20μL～100μLDEPC處理水溶解8.2.1配制逆轉(zhuǎn)錄引物預混液體系，分裝為5pμL/管，使每反應(yīng)管含4μLDEPC處理水、1pL10μmol/L引物9195R,保存于-20℃。臨用前，加入1pL(質(zhì)量濃度：1ng/μL～1000ng/μL)待測RNA樣品。70℃預變性10min后，即刻放入冰浴中冷卻2min。同時設(shè)置以DEPC處理水為模板的4GB/T40257—20218.2.3PCR反應(yīng)體系：按照表1的要求，配制成除TaqDNA聚合酶以外的大體積預混物，分裝保存于-20℃。臨用前，加入相應(yīng)體積的TaqDNA聚合酶，混勻，按1個反應(yīng)體系/支分裝到0.2mLPCR管中。分別加入相應(yīng)體積的各樣品逆轉(zhuǎn)錄cDNA。8.2.4將上述加有逆轉(zhuǎn)錄cDNA的PCR管按以下程序進行擴增：94℃預變性5min;94℃變性30s、8.2.5可使用同等效果的逆轉(zhuǎn)錄或一步法RT-PCR商品化試劑盒進行操作。表1RT-PCR的PCR反應(yīng)預混物所需試劑·組成試劑試劑終濃度10×PCR緩沖液(無Mg2+)1×PCR緩沖液dNTPs(各2.5mmol/L)引物9992F(10pmol/L)引物9195R(10pmol/L)滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)8.3.1配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加入10mg/mLEB至終濃度0.5μg/mL,搖勻。制備瓊脂糖凝膠。8.3.2將5pLPCR反應(yīng)產(chǎn)物與1μL6×載樣緩沖液混勻后加入到加樣孔中。同時設(shè)立DNA分子量標準對照。8.3.3在1V/cm～5V/cm的電壓下電泳，使DNA由負極向正極移動。當載樣緩沖液中的溴酚藍指示劑的色帶遷移至瓊脂糖凝膠的1/2～2/3處時停止電泳，將凝膠置于紫外觀察儀或凝膠成像儀下觀察或拍照。8.3.4如果觀察到預期大小條帶，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序。9結(jié)果判定陽性對照在231bp處有特定條帶、陰性對照在231bp處無條帶且空白對照不出現(xiàn)任何條帶，試驗有效。檢測樣品在231bp處有條帶，且PCR產(chǎn)物測序結(jié)果同參考序列(參見附錄C)進行比對，結(jié)果符合的可判為RT-PCR結(jié)果陽性；檢測樣品在231bp處無條帶可判為RT-PCR結(jié)果陰性。5GB/T40257—2021(規(guī)范性)A.1無RNA酶的75%乙醇無水乙醇(新開瓶)75mL加入DEPC處理水25mL管中，保存于-20℃待用。A.250×電泳緩沖液Tris242g冰乙酸57.1mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)加水定容至1000mL室溫貯存。A.31×電泳緩沖液50×電泳緩沖液20mL加水定容至1000mL室溫貯存。A.410mg/mLEB貯存液磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解。室溫保存于棕色瓶或用鋁鉑包裹的瓶中。6GB/T40257—2021(資料性)桃拉綜合征簡介桃拉綜合征(infectionwithtaurasyndromevirus)是由桃拉綜合征病毒(TSV)引起的對蝦嚴重流行病。TSV的形態(tài)為正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑32nm,無囊膜，氯化銫浮力密度1.338g/mL,在細胞質(zhì)內(nèi)復制，核酸為正鏈單股線性RNA,長度約10205個核苷酸，其衣殼主要由三種多肽(VP1、VP2和VP3)目前，TSV廣泛分布于美洲、東南亞和中東等對蝦養(yǎng)殖地區(qū)。1992年，厄瓜多爾養(yǎng)殖的凡納濱對蝦中首次發(fā)生TSV感染疫情。隨著受感染仔蝦和親蝦運輸，TSV快速傳播到美洲。1999年，傳入中國臺北，繼而影響中國大陸、泰國、馬來西亞和印度尼西亞，并成為各地區(qū)對蝦高死亡率的主要流行病原。TSV易感品種包括細角濱對蝦、凡納濱對蝦、刀額新對蝦(Metapenaeusensis)、褐對蝦(Penaeusaztecus)、斑節(jié)對蝦(P.monodon)、白對蝦(P.setiferus)。主要感染14日～40日齡仔蝦。稚蝦或成蝦初次遇到病毒時也易被感染。急性期：TSV急性感染期的瀕死凡納濱對蝦全身呈淺紅色，尾扇和泳足呈鮮紅色，亦曾被俗稱為“紅尾病”。對蝦常在蛻皮時死亡，且在蛻皮階段晚期出現(xiàn)殼變軟、空腸等典型癥狀。因瀕死蝦多漂浮于池邊或水面，疫病暴發(fā)高峰期間可見數(shù)以千計的海鳥(海鷗、燕鷗、蒼鷺、鸕鶿等)聚集在池邊或水面捕食病蝦。經(jīng)顯微鏡觀察病蝦附肢(如末端尾肢或腹肢),可見病灶處表皮上皮壞死。過渡(恢復)期：該時期的種群中可能仍有尚多急性感染期對蝦，死亡率仍很高。蝦池中，可見對蝦表皮隨機出現(xiàn)多處不規(guī)則的由血細胞積累而成的黑色病灶，表皮變軟及紅色素擴散，行為和攝食保持正常。慢性期：過渡期的病蝦在蛻皮后轉(zhuǎn)入慢性期，病毒感染持續(xù)，但無明顯癥狀。此感染期的細角濱對蝦對正常環(huán)境刺激(如鹽度突然降低等)的抵抗力低于無感染對蝦