2024胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法

胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法PAGEPAGE10胎兒彎曲桿菌的分離鑒定方法范圍本文件規(guī)定了胎兒彎曲桿菌（Campylobacterfetus）的分離鑒定方法。（GB/T6682GB19489 本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。縮略語下列縮略語適用于本文件。PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction）實時熒光PCR：實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-timepolymerasechainreaction）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）rRNA：核糖體核糖核酸（Ribosomalribonucleicacid）Ct值：循環(huán)閾值（CycleThresholdvalue）PCRPCR（412000g以上。5.6天平0.01g.0001。5.7冰箱（2℃~8-20。（0.2μL~2μL、1μL~10、10μL~100、20μL~200、100μL~1000μL，并配。（5%10%85%氮氣。5.12（10×~100×）（MALDI-TOFMS）5.1836℃±11005.19要求GB/T6682GB/T6682規(guī)定的二級水。培養(yǎng)基按附錄A（tanspotenrchentedu,TEMA的1Skirrow血瓊脂：按照附錄AA.2哥倫比亞血瓊脂：按照附錄AA.3AA.4氧化酶溶液：按照附錄AA.53%過氧化氫溶液：按照附錄AA.6疏基乙酸鹽肉湯：按照附錄AA.7馬尿酸鈉水解試劑：按照附錄AA.85%PBS。PCR-氰-（AC胎兒彎曲桿菌胎兒亞種ATCC27374或胎兒彎曲菌性病亞種ATCC19438。材料細菌DNA（。2mL520樣品樣品TEMTEM增菌運輸培養(yǎng)基36℃±1℃ 3d接種于接種于Skirrow培養(yǎng)基36℃±1℃ 質(zhì)譜鑒定生化鑒定3636℃±1℃ 質(zhì)譜鑒定生化鑒定可疑菌落接種于哥倫比亞血瓊脂 可疑菌落提取可疑菌落接種于哥倫比亞血瓊脂可疑菌落提取DNA四選一四選一實時熒光PCR鑒定PCR鑒定胎兒彎曲桿菌5%mL5%20mL~30mLPBS15s~20s5%PBS5%AI3mL5%AI20mL~30mLPBS4~5無菌采集流產(chǎn)胎兒的肝、肺和胃內(nèi)容物及胎盤，置于無菌塑封袋或其它密閉容器中。低溫（4℃~8℃保存，避免直接接觸冰塊）微需氧環(huán)境下保存樣品，盡快送至實驗室檢測。若樣品不能在采樣當(dāng)天送達實驗室，可將樣品液靜置1min-2min，用滅菌注射器吸取上清液1mL，注入增菌運送培養(yǎng)基（TEM）中送檢。分離300Skirrow36℃±13d~5d。3500g500μLPBS36℃±13d~5d。SkirrowSkirrowPBSSkirrow36℃±13d~5d。36℃±1200μLSkirrow36℃±13d~5d。純化Skirrow1~336℃±1℃培養(yǎng)3d~5d（不少于3個）進行后續(xù)鑒定。挑取純化菌落，革蘭氏染色、鏡檢。胎兒彎曲桿菌為革蘭氏染色陰性，呈螺旋狀或“S”狀，一些老齡培養(yǎng)物可出現(xiàn)球狀或球桿狀，不形成芽胞和莢膜，在菌體的一端或兩端有鞭毛。挑取純化菌落，懸浮于1mL布氏肉湯中，用相差顯微鏡觀察，胎兒彎曲桿菌呈螺旋狀運動。用鉑/銥接種環(huán)或玻璃棒挑取純化菌落至氧化酶試劑潤濕的濾紙上，如果在10s內(nèi)出現(xiàn)紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽性。3%30s（H2S）試驗20×6mm61℃72h，如見濾紙變黑即為產(chǎn)生H2S8.4.6254225℃±142℃±13d1%3.5%3d，0.4mLl%20.2mL茚三,20min注：上述生化實驗也可使用商品化生化鑒定試劑盒、生化鑒定卡、微生物生化鑒定系統(tǒng)進行。1表1胎兒彎曲桿菌生化反應(yīng)菌名氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硫化氫試驗生長試驗馬尿酸鈉水解試驗25℃42℃1%甘氨酸3.5%氯化鈉胎兒彎曲桿菌胎兒亞C.fetussubsp.fetus+++VVb+--胎兒彎曲桿菌性病亞種C.fetussubsp.venerealis+V-VVb空腸彎曲桿菌C.jejuni+Va+-VcV-+豚腸彎曲桿菌C.hyointestinalis++n.d.-+V-n.d.唾液彎曲桿菌C.sputorum+Vn.d.-+++n.d.”——陽性反應(yīng)；“-”——陰性反應(yīng)；“V”反應(yīng)不定；“n.d.”未確定；空腸彎曲桿菌空腸亞種陽性,;42°C生長;空腸彎曲桿菌空腸亞種陽性，空腸彎曲桿菌德萊亞種陰性。PCRDNA從哥倫比亞血瓊脂上挑取4~5個胎兒彎曲桿菌疑似單菌落于500μL無菌水中混勻，放置于干式恒溫金屬浴中10min，冷卻后，12000g離心2min，上清液即為DNA模板。獲得的DNA模板立即使用或放入-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。也可使用等效的商品化細菌DNA提取試劑盒并按其說明書制備DNA模板。PCR胎兒彎曲桿菌引物信息見表2。2PCR檢測用引物探針信息組分名稱序列目的基因片段長度MG3FGGTAGCCGCAGCTGCTAAGATcstA764bpMG4RTAGCTACAATAACGACAACT檢測過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。使用胎兒彎曲桿菌胎兒亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27374或胎兒彎曲菌性病亞種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19438為陽性對照，使用除胎兒彎曲桿菌之外的其他彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陰性對照，以無菌雙蒸水為空白對照。每個樣品設(shè)3次重復(fù)。PCR胎兒彎曲桿菌PCR檢測，反應(yīng)體系見表3。表3胎兒彎曲桿菌PCR反應(yīng)體系組分名稱體積（μL）PCR預(yù)混液（2×）12.5上游引物（10μmol/L）1.0下游引物（10μmol/L）1.0DNA模板（20ng/μL）2.0無菌雙蒸水8.5總量25.0PCR95330s54℃退火30110。電泳取PCR擴增產(chǎn)物，于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析。（764陽性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?64bp）的擴增條帶，且經(jīng)測序驗證為目標(biāo)條帶，判定PCR結(jié)果為陽性，該菌株是胎兒彎曲桿菌。陰性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，待測樣品出現(xiàn)預(yù)期大?。?64bp）的擴增條帶，且經(jīng)測序驗證為非目標(biāo)條帶，判定PCR結(jié)果為陰性，該菌株不是胎兒彎曲桿菌。（764PCRPCR產(chǎn)物電泳圖見附錄B的B.1，片段測序結(jié)果見附錄B的B.2。PCRDNA同8.5.1.PCR胎兒彎曲桿菌的引物探針信息見表4。4PCR組分名稱序列目的基因片段長度16SFw5′-GCACCTGTCTCAACTTTC-3′16SrRNA78bp16SRv5′-CCTTACCTGGGCTTGAT-3′16SPb5′-VIC-ATCTCTAAGAGATTAGTTG-MGB/NFQ-3′同8.5.2.2。PCR胎兒彎曲桿菌實時熒光PCR反應(yīng)體系見表5。表5胎兒彎曲桿菌實時熒光PCR反應(yīng)體系組分名稱體積（μL）PCR（2×）10.0上游引物（10μmol/L）0.4下游引物（10μmol/L）0.4探針（10μmol/L）0.2DNA模板（20ng/μL）4.0無菌雙蒸水5.0總量20.0PCR955min，9510305min（60PCRPCR。CtCt值陽性結(jié)果：SCtPCR結(jié)果陽性，該菌株是胎兒彎曲桿菌。S35<Ct40C3，PCR陰性結(jié)果：在質(zhì)控系統(tǒng)正常的情況下，被檢樣品無特異性S型擴增曲線，判定為實時熒光PCR結(jié)果陰性，該菌株不是胎兒彎曲桿菌。胎兒彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株實時熒光PCR擴增曲線見附錄C的C.1。1檢測樣品前，應(yīng)對微生物質(zhì)譜儀進行校準(zhǔn)。測定取制備好的樣品靶板置質(zhì)譜儀靶板槽中。編輯樣品信息后，進行譜圖數(shù)據(jù)采集。DD.1。生化鑒定、PCR鑒定、實時熒光PCR鑒定和質(zhì)譜鑒定四種方法任選其一。實驗室設(shè)施設(shè)備、人員防護及實驗的安全操作、實驗廢棄物和菌種的處理應(yīng)符合GB19489的要求。附錄A（）(transportenrichmentmedium,TEM)成分5-1000mL0.3g0.13多粘菌B100000IU1%煌綠5mLA.1.2制法A.1.120mL的玻82min--3min(無壓力)氧氣(O2)10%(CO2),85%氮氣(N2)]TEM44個月。Skirrow（Skirrowbloodagar）蛋白胨 15.0g胰蛋胨 2.5g酵母膏 5.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 15.0g蒸餾水 1000.0mL將A.2.1.1中各成分溶于蒸餾水中，121℃滅菌15min，備用。FBP溶液丙酮鈉 0.25g焦亞酸鈉 0.25g硫酸鐵 0.25g蒸餾水 100.0mL將A.2.2.10.22FBP-70℃儲存不超過-20萬古素（vancomycin） 0.0075g三甲芐氨啶（trimethoprim） 0.0038g多粘素B（polymyxinB） 1900IU放線酮（actidione） 0.0375g兩性素B（amphotericinB） 5.0g乙醇/滅水（50/50，體積數(shù)） 5.0mL將A.2.3.1中各成分溶解于乙醇/滅菌水混合溶液中。10基礎(chǔ)養(yǎng)基 1000.0mLFBP溶液 5.0mL抗生溶液 5.0mL無菌纖綿血 50.0mL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度約為45℃左右時，加入FBP溶液、抗生素溶液與凍融的無菌脫纖維綿羊血，混勻。校正pH至7.4±0.2（25℃）。傾注15mL于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。預(yù)先制備的平板未干燥時在室溫放置不得超過4h，或在4℃左右冷藏不得超過7d。動物織解物 15.0g淀粉 1.0g氯化鈉 5.0g瓊脂 8.0~18.0g蒸餾水 1000.0mL將A.3.1.1中各成分溶于蒸餾水中，121℃滅菌15min，備用。10基礎(chǔ)養(yǎng)基 1000.0mL無菌纖綿血 50.0mL當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的溫度為45℃左右時，無菌加入綿羊血，混勻。校正pH至7.3±0.2（25℃）。傾注15mL完全培養(yǎng)基于無菌平皿中，靜置至培養(yǎng)基凝固。制備的平板未干燥時在室溫放置不得超過4h，或在4℃左右冷藏不得超過7d。酪蛋白酶解物動物組織酶解物10.0g10.0g葡萄糖1.0g酵母浸膏2.0g氯化鈉5.0g亞硫酸氫鈉0.1g蒸餾水1000.0mL將.4.11H至7.002（25℃1215i，備用。1%3（H2O2）30%H2O2 10mL蒸餾水 90mL裝于棕色瓶中，有效期為一周。成分胱氨酸 0.5mg氯化鈉 2.5mg右旋糖 5.5g酵母膏 5.0g（PancreaticDigestofCasein）15.0g巰基酸鈉 0.5g蒸餾水 1000.0mL制法A.6.1pH7.2±0.2,5mLkPa151%馬尿鈉 1g蒸餾水 100mL茚三酮 3.5g丙酮 50mL丁酮 50mL附錄B（資料性）胎兒彎曲桿菌PCR產(chǎn)物大小和測序結(jié)果對照cstAPCR見圖B.1。圖B.1 兒曲標(biāo)菌菌cstAPCR物圖M：DL2000DNAMarker；1：胎兒彎曲桿菌ATCC27374cstAtatttatattaaccgcggttgatgccggtactagaacaggacgatttatggtacaagatatactaggtaacgttcataaaccaataggtgatacaaaaaactggttttggggtattatagctactataatatgcgttactggctggggatacctactatatagcggtgttactgaccctatgggaggtatattcacactttggcctctatttggcgcggcaaatCaaatgctagccggcatcgctcttatgcttggaaccgtagtattatttaaaatgggaaaagcaaaatactcatgggttactatagctcctcttgtttgggtgcttataactacaatgtatgcagcatatcaaaaacttcttccggcaaatggagagagagttcatgacgccgtaagtcacatagctactgct