谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書

第第頁谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差別大的樣本做猜測定。測定意義：GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內(nèi)GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應(yīng)中對活性氧清除起關(guān)鍵作用，另外GR還參加抗壞血酸—谷胱甘肽循環(huán)途徑。測定原理：GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340nm有特征汲取峰，相反NADP+在該波長無汲取峰；通過測定340nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。自備儀器和用品：低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水試劑構(gòu)成和配置：試劑一：液體120mL×1瓶，4℃保管。試劑二：粉劑×2支，20℃保管。臨用前加入1.2mL蒸餾水，混勻。試劑三：粉劑×2支，20℃保管。臨用前加入0.6mL蒸餾水，混勻。粗酶液提取：1.組織：依照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測。2.細(xì)菌、真菌：依照細(xì)胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波碎裂細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心15min，取上清置于冰上待測。3.血清等液體：直接測定。操作步驟：1.分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，調(diào)整波長到340nm，蒸餾水調(diào)零。2.試劑一置于25℃（普通物質(zhì)）或者37℃（哺乳動物）中預(yù)熱30min。3.測定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10μL試劑三，20μL試劑二，150μL試劑一，20μL上清液，混勻，于340nm快速測定初始吸光度和180s吸光度，記為A測1和A測2，△A測定管=A測1—A測2、注意：1.加完上清液后必需快速混勻測定，保證準(zhǔn)確測出初始反應(yīng)速度；2.當(dāng)顯現(xiàn)初始180s內(nèi)吸光值不穩(wěn)定時，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間，選取相對穩(wěn)定的時間段內(nèi)吸光值變動值；3.當(dāng)所測△A測定管的值在零點相近徘徊時，可能原因：（1）樣本GR酶活性低，建議濃縮樣本后再進(jìn)行測定；（2）樣本GR酶活性過高，吸光值變動區(qū)間過小無法準(zhǔn)確測出，建議樣本稀釋2～5倍后再進(jìn)行測定）計算公式：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）.按蛋白濃度計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/mgprot）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=536×△A測定管÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/g鮮重）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=536×△A測定管÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/104cell）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=536×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/mL）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=536×△A測定管ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×104L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=2×102mL；V樣總：提取液體積，1mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3min。b.使用96孔板測定的計算公式如下（1）.按蛋白濃度計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/mgprot）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷[Cpr×V樣]÷T=1072×△A測定管÷Cpr（2）.按樣本質(zhì)量計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每克樣本每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/g鮮重）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1072×△A測定管÷W（3）按細(xì)胞數(shù)量計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每104個細(xì)胞每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/104cell）=[△A測定管÷ε÷d×V反總×109]÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T=1072×△A測定管÷細(xì)胞數(shù)量（4）按液體體積計算活性單位定義：在肯定溫度中，pH8.0條件下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH氧化為1個酶活單位。GR酶活（nmol/min/mL）=[（△A測定管△A空白管）÷ε÷d×V反總×109]÷×V樣÷T=1072×△A測定管ε：NADPH摩爾消光系數(shù)6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×104L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=2×102mL；V樣總：提取液體積，1mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3min。注意事項：（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測定酶活力，勻漿液避開反復(fù)凍融；（2）試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)