響應(yīng)面法優(yōu)化N-乙酰氨基葡萄糖發(fā)酵液精制純化工藝

背景介紹N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）是生物體內(nèi)的一種含氮單糖，廣泛存在于細菌、植物和動物體內(nèi)，是甲殼素的結(jié)構(gòu)單元，NAG具有消炎、抗腫瘤和抗氧化等多種生物活性，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、材料、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。通過微生物發(fā)酵將葡萄糖等生物質(zhì)穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)化為NAG及其衍生物是氨糖產(chǎn)品目前主流的工業(yè)化生產(chǎn)方式。但發(fā)酵過程中產(chǎn)生的發(fā)酵液組成復(fù)雜，關(guān)鍵雜質(zhì)不明確，現(xiàn)有純化和精制工藝尚不能解決制約產(chǎn)品純度和品質(zhì)的難題。因此針對實際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵液，開發(fā)適用于NAG分離純化的新工藝，發(fā)現(xiàn)并鑒定出影響產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵雜質(zhì)，降低企業(yè)的產(chǎn)品損失與母液處理量具有重大的經(jīng)濟與社會意義。文章亮點1.

針對實際工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵液，開發(fā)了適用于發(fā)酵液中NAG分離純化的新工藝，篩選出關(guān)鍵分離介質(zhì)并優(yōu)化了分離工藝；2.測定了分離介質(zhì)的再生性能并獲得了可應(yīng)用于實踐的脫鹽率、脫色率和NAG回收率的回歸方程；3.確定了影響產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵雜質(zhì)，提高了NAG純度與結(jié)晶率并減少母液量，降低了企業(yè)的產(chǎn)品損失并解決了部分廢液處理問題。內(nèi)容介紹1

實驗部分1.1

主要儀器與試劑1.2

實驗方法1.2.1

發(fā)酵液的預(yù)處理NAG發(fā)酵液由山東潤德生物科技有限公司提供，通過超濾膜除去發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，收集超濾膜透過液作為預(yù)處理發(fā)酵液，將超濾膜透過液中NAG濃度稀釋至20mg/mL作為樹脂精制純化的初始原料。1.2.2

樹脂的預(yù)處理將干樹脂置于飽和NaCl溶液中溶脹24h并用去離子水洗凈，陽離子交換樹脂先用3%NaOH溶液清洗3h，樹脂用去離子水洗凈后，再用5%HCl溶液清洗6h，最后用去離子水洗至樹脂流出液為中性。2

結(jié)果與討論2.1

預(yù)處理發(fā)酵液成分分析采用超濾膜對NAG發(fā)酵液進行預(yù)處理，收集超濾膜透過液并以NAG、蛋白質(zhì)含量、電導(dǎo)率、OD420為檢測指標(biāo)進行測定，結(jié)果如表1所示。2.2

樹脂篩選結(jié)果如圖1與圖2所示，對比不同型號樹脂對發(fā)酵液脫鹽率與脫色率的影響，發(fā)現(xiàn)弱酸性陽離子交換樹脂DS-1對發(fā)酵液的脫鹽效果最佳，強堿性陰離子交換樹脂HS-3對發(fā)酵液的脫色效果最佳，因此，選擇DS-1樹脂與HS-3樹脂對發(fā)酵液進行精制純化。圖1

不同樹脂脫鹽效果對比圖2

不同樹脂脫色效果對比2.3

單因素實驗結(jié)果2.3.1

陰陽離子交換樹脂體積比對發(fā)酵液精制純化效果影響陰陽離子交換樹脂體積比對發(fā)酵液精制純化效果的影響如圖3所示。圖3

陰陽離子交換樹脂體積比對發(fā)酵液精制純化效果影響2.4

響應(yīng)面優(yōu)化精制純化工藝根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇陰陽離子交換樹脂體積比、上樣濃度、溫度為實驗因素，進行三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，將溫度、上樣濃度、陰陽離子交換樹脂體積比分別固定，發(fā)酵液脫鹽率隨其余2個參數(shù)變化的響應(yīng)面圖與等高線圖如圖4所示。a、b分別為

上樣濃度、陰陽離子交換樹脂體積比的響應(yīng)面圖和等高線圖；c、d分別為

溫度、陰陽離子交換樹脂體積比的響應(yīng)面圖和等高線圖；e、f分別為

溫度、上樣濃度的響應(yīng)面圖和等高線圖圖4

發(fā)酵液脫鹽率的響應(yīng)面圖與等高線圖3

結(jié)論針對復(fù)雜的NAG發(fā)酵液體系，本文開發(fā)了適用于NAG精制純化的新工藝。篩選了由DS-1樹脂與HS-3樹脂組成的適用于NAG發(fā)酵液精制純化的樹脂組合，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過對陰陽離子交換樹脂體積比、上樣濃度、溫度進行響應(yīng)面分析實驗，得到NAG發(fā)酵液精制純化的最佳條件為陰陽離子交換樹脂體積比0.35:1、上樣濃度65mg/mL、溫度41℃，此時發(fā)酵液脫鹽率為96.9%，脫色率79.5%，NAG回收率84.5%，NAG結(jié)晶純度