第二章 基因突變及其機(jī)制課件

第三章基因變異與重組 第一節(jié)突變類型和基因符號第二節(jié)基因突變的規(guī)律第三節(jié)自發(fā)突變的機(jī)制 第四節(jié)誘變劑及其作用機(jī)理 第五節(jié)突變生成過程第二章基因突變及其機(jī)制第一節(jié)突變類型及基因符號定義1：突變是指生物表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。定義2：突變是指生物生長過程中，由于內(nèi)因或外因的作用導(dǎo)致染色體DNA結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生的改變。突變體：帶有突變基因的細(xì)胞或個體突變型：突變體的基因型或表型稱為突變型，和其相對的原存在狀態(tài)稱為野生型。第二章基因突變及其機(jī)制誘發(fā)突變的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于自發(fā)突變頻率.一、突變類型（一）、按突變發(fā)生原因分類自發(fā)突變(spontaneousmutagenesis)：未經(jīng)任何人為的處理而自然地發(fā)生的突變，稱為自發(fā)突變。誘發(fā)突變(inducedmutagenesis)：由人們有意識地利用物理或化學(xué)手段引起的突變稱為誘發(fā)突變。第二章基因突變及其機(jī)制突變可以發(fā)生在染色體水平或基因水平，發(fā)生在染色體水平的突變稱為染色體畸變，發(fā)生在基因水平的突變稱為基因突變。（二）、按變化范圍分突變類型1)整倍體(euploidy)：含有完整的染色體組①單倍體：haploid②二倍體：diploid③三倍體：triploid④四倍體：tetraploid1染色體畸變（chromosomeaberration)染色體數(shù)目的變化或染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生較大片段的異常改變。(1)染色體數(shù)目的變化第二章基因突變及其機(jī)制①單體（二倍減一，monosomicdiploid):2n-1②缺體（二倍減二，nullisomicdilpoid):2n-2③三體（二倍加一，trisomicdiploid):2n+1④四體（二倍加二，tetrasomicdiploid):2n+2⑤雙二倍加一（doubletrisomic）:2n+1+1⑥部分二倍體（merodiploid）：細(xì)菌等原核生物中由一整條染色體和外來的一個染色體片段所構(gòu)成的不完整二倍2)非整倍體aneuploidy：含有不完整狀態(tài)的染色體組，一般是指二倍體中成對染色體成員的增加或減少。第二章基因突變及其機(jī)制?涉及到DNA分子上較大范圍的變化，往往會涉及到多個基因。(2)染色體結(jié)構(gòu)的變化?染色體結(jié)構(gòu)的改變，多數(shù)是染色體或染色單體遭到巨大損傷產(chǎn)生斷裂，而斷裂的數(shù)目、位置、斷裂端連接方式等造成不同的突變.?包括染色體缺失、重復(fù)、倒位和易位等第二章基因突變及其機(jī)制d-相互易位a-缺失b-重復(fù)c-倒位①缺失deficiency：是染色體片段的丟失。細(xì)胞學(xué)效應(yīng)：缺失環(huán)遺傳學(xué)效應(yīng)：這種突變往往是不可逆的損傷，其結(jié)果會造成遺傳平衡的失衡。②重復(fù)repetition：是染色體片段的二次出現(xiàn)。細(xì)胞學(xué)效應(yīng)：重復(fù)環(huán)遺傳學(xué)效應(yīng)：這種突變有可能獲得具有優(yōu)良遺傳性狀的突變體。③倒位inversion：是指染色體的片段發(fā)生了180°的位置顛倒細(xì)胞學(xué)效應(yīng)：倒位環(huán)遺傳學(xué)效應(yīng)：造成染色體部分節(jié)段的位置順序顛倒，極性相反。④易位translocation：是指一個染色體的一個片段連接到另一個非同源染色體上。相互易位reciprocaltranslocation：兩個非同源染色體間相互交換一部分。相互易位的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)：十字型圖象第二章基因突變及其機(jī)制點突變pointmutation：單堿基對的置換突變發(fā)生在一個基因范圍內(nèi)。多位點突變：突變超出一個基因范圍。(2)基因突變（genemutation）?基因突變是指一個基因內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)或DNA序列的任何改變，包括一對或少數(shù)幾對核苷酸的缺失、插入或置換，分為堿基置換和移碼突變。根據(jù)染色體局部座位內(nèi)的變化范圍第二章基因突變及其機(jī)制(2)顛換transversion：DNA鏈中一個嘌呤（嘧啶）被一個嘧啶（嘌呤）所置換。1、堿基置換basepairsubstitutionDNA鏈上一個堿基對為另一堿基對所取代叫堿基置換(1)轉(zhuǎn)換transition：DNA鏈中一個嘌呤（嘧啶）被另一個嘌呤（嘧啶）所置換。第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制一般只引起一個基因的表達(dá)出現(xiàn)錯誤。2、移碼突變frameshiftmutation在DNA序列中由于一對或少數(shù)幾對核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生移動，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的突變叫移碼突變。第二章基因突變及其機(jī)制——同義突變（synonymymutation）和沉默突變（silentmutation）。（三）按突變是否引起遺傳編碼特性的改變分類?一類是引起遺傳性狀改變：——錯義突變（missensemutation），無義突變（nonsensemutation）和移碼突變?一類不改變遺傳性狀的突變第二章基因突變及其機(jī)制③移碼突變frameshiftmutation:在DNA序列中由于一對或少數(shù)幾對核苷酸的插入或缺失，而使其后全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生移動，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯錯誤的突變。①錯義突變missensemutation：突變后的密碼子代表另一種氨基酸。個別堿基的改變導(dǎo)致多肽鏈上某個氨基酸為另一種氨基酸所取代。例：GGC突變?yōu)锳GC，編碼的氨基酸由甘氨酸變成色氨酸。②無義突變nonsensemutation：突變后的密碼子代表終止密碼。例：AAG（亮氨酸）突變?yōu)閁AG（終止密碼子）。第二章基因突變及其機(jī)制⑤沉默突變：表型不發(fā)生改變的基因突變。包括同義突變和氨基酸序列發(fā)生改變而不影響蛋白質(zhì)功能的錯義突變。④同義突變：突變后的密碼子編碼的仍是同一種氨基酸。堿基序列發(fā)生改變而氨基酸序列未發(fā)生改變的隱蔽突變。例：ATT突變?yōu)锳TC，兩者都編碼異亮氨酸。?同義突變的發(fā)生是由于遺傳密碼的簡并性。?同義突變不會導(dǎo)致編碼特性的改變，但往往會引起限制酶切割位點的變化，造成DNA限制片段長度的多態(tài)性第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制Tyr酪氨酸UAG:琥珀型(Amber,Am)

UAA:赭石型(Ochre,Och)UGA:乳石型(Opal,Opal)第二章基因突變及其機(jī)制?野生型wildtype：表現(xiàn)該物種正常表型的生物。?突變型mutant：由于突變導(dǎo)致其正常的表型發(fā)生了改變的生物。（四）、按突變的表型變化效應(yīng)分類第二章基因突變及其機(jī)制1.形態(tài)突變型morphologicalmutant：引起細(xì)胞個體形態(tài)和菌落形態(tài)發(fā)生改變的突變型。是一種可見突變。2.生化突變型：引起特定生化功能的喪失而無形態(tài)學(xué)效應(yīng)的突變型。包括營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型、糖代謝突變型等。①營養(yǎng)缺陷型auxotrophicmutant：由于代謝過程的缺陷而不能合成某種與合成初級代謝物有關(guān)的基因產(chǎn)物的缺陷型。②抗性突變型resistantmutant：由于基因突變而產(chǎn)生的對某種化學(xué)藥物、致死物理因子或噬菌體具有抗性的變異菌株a)抗藥物突變型：對原本敏感的藥物具有一定的耐性。b)抗噬菌體突變型：對原本敏感的噬菌體產(chǎn)生抗性。第二章基因突變及其機(jī)制3.致死突變型lethalmutant：由于基因突變造成個體死亡的突變型。?雜合狀態(tài)的顯性致死和純合狀態(tài)的隱性致死都導(dǎo)致個體的死亡4.條件致死突變型conditionlethalmutant：在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。如：溫度敏感突變型temperature-sensitivemutant6.產(chǎn)量突變型metabolitequantitativemutant:所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯有別于原始菌株的突變株稱產(chǎn)量突變型5.調(diào)節(jié)突變型regulatorymutant：喪失對某一基因或操縱子表達(dá)能力調(diào)節(jié)的突變型。第二章基因突變及其機(jī)制突變類型按突變發(fā)生原因分自發(fā)突變誘發(fā)突變按變化范圍分染色體畸變數(shù)目的變化:整倍體/非整倍體結(jié)構(gòu)的變化:缺失、重復(fù)、倒位和易位等基因突變堿基置換:轉(zhuǎn)換/顛換移碼突變點突變/多位點突變按是否引起表型的改變分引起遺傳性狀改變:錯義突變/無義突變/移碼突變不改變遺傳性狀的突變:同義突變/沉默突變按突變的表型變化效應(yīng)分形態(tài)突變型生化突變型:營養(yǎng)缺陷型/抗性:抗藥物/噬菌體致死突變型條件致死突變型調(diào)節(jié)突變型產(chǎn)量突變型第二章基因突變及其機(jī)制二基因符號基因命名原則1966年M.Demerec等提出《TIG遺傳命名指南》提出基因的名稱由該基因突變后的表現(xiàn)型效應(yīng)來命名第二章基因突變及其機(jī)制表現(xiàn)型或基因型表示符號表現(xiàn)型具有合成或利用某種物質(zhì)的能力缺乏合成或利用某種物質(zhì)的能力具有對某種抗生素的抗性具有對某種抗生素的敏感性Sub＋Sub－

AntrAnts基因型能夠合成或利用某種物質(zhì)的野生型基因影響合成或利用某種物質(zhì)的突變基因突變的subA基因subA基因的63號突變具有溫度敏感表型的subA基因突變sub＋sub－subA－subA63subA（Ts）第二章基因突變及其機(jī)制每一基因座位（locus）用三個斜體小寫英文字母表示，它們來自說明這一基因特性的一個或一組英文單詞的前三個字母；如lac(lactose),his(histidine)；rps(ribosomalproteinsmallsubunit),rim(ribosomalmodification)產(chǎn)生同一突變型表型的不同基因，在三個小寫字母后用不同的一個大寫斜體字母來表示；如trpA,trpB同一基因的不同突變位點（mutationsite）在基因符號后用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。如trpA23突變型的基因符號用基因座符號加上加/減號（“+/-”）或其他符號(“r/s”)來表示。如leu+，his-;strr基因表型和產(chǎn)物用相應(yīng)基因型的正寫字母表示，其中第一個字母大寫。如lacZ-LacZ-第二章基因突變及其機(jī)制突變的特征第二節(jié)基因突變的規(guī)律自發(fā)性隨機(jī)性稀有性獨立性可誘變性可遺傳性可逆性(一)突變的特征第二章基因突變及其機(jī)制說明：E.coli對噬菌體的抗性是在接觸噬菌體之前的細(xì)胞分裂過程中自發(fā)產(chǎn)生的。波動實驗1943，Luria&Delbrück設(shè)計突變的自發(fā)性第二章基因突變及其機(jī)制1952，Lederberge夫婦設(shè)計影印培養(yǎng)實驗直接證明抗藥微生物的產(chǎn)生是自發(fā)產(chǎn)生的，與鏈霉素的使用無關(guān)；鏈霉素只是起到篩選作用。第二章基因突變及其機(jī)制基因突變的發(fā)生從時間、個體、位點和所產(chǎn)生的表型變化等方面都帶有比較明顯的隨機(jī)性。突變的隨機(jī)性突變總是以一定的頻率在群體中發(fā)生第二章基因突變及其機(jī)制5-甲基胞嘧啶（MeC）的存在發(fā)生DNA上短的連續(xù)重復(fù)序列處突變熱點也還與誘變劑有關(guān)突變熱點（hotspotsofmutation）DNA分子上各個部分有著不同的突變頻率，某些位點的突變頻率大大高于平均值，這些位點稱為突變熱點形成突變熱點的最主要的原因第二章基因突變及其機(jī)制突變的稀有性抗藥性突變以一定的突變率發(fā)生在個別細(xì)胞中。正常情況下，突變發(fā)生的頻率往往很低。突變率（mutationrate）

：指在一個世代或其他規(guī)定單位時間，在特定環(huán)境條件下，一個細(xì)胞產(chǎn)生某一性狀突變的概率。也可指某一群體在某一世代（即分裂一次）產(chǎn)生的突變菌株數(shù)目?；蜃园l(fā)突變概率在10-9-10-6，轉(zhuǎn)座突變在10-4，無義錯義突變概率在10-8第二章基因突變及其機(jī)制細(xì)胞分裂非同步性教正：突變率=ln2m=0.69m突變率（m）的計算固體平板法測突變率：m=(M2-M1)/(N2-N1)液體培養(yǎng)法測突變率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)液體稀釋法測突變率：P0=e-mN細(xì)菌數(shù)N突變數(shù)M分裂次數(shù)g突變率m突變試管與總試管數(shù)比值P0第二章基因突變及其機(jī)制分裂次數(shù)01234細(xì)菌總數(shù)N2N4N8N16N原有突變型數(shù)M=mN2mN4mN8mN16mN新增加突變型數(shù)mN2mN4mN8mN突變型/野生型(1/2)mm(3/2)m2m液體培養(yǎng)中細(xì)菌數(shù)和突變型數(shù)的關(guān)系分裂g次后的比數(shù)是(1/2)gm液體培養(yǎng)法測突變率：m=2(M2/N2-M1/N1)/(g2-g1)第二章基因突變及其機(jī)制例：在20個試管中有11個試管不含任何突變型細(xì)菌，每一試管的平均細(xì)菌數(shù)N測得是5.6×108P0=e-mNP0=11/20=0.55m=-lnP0/N=0.6/(5.6×108)=1.2×10-8第二章基因突變及其機(jī)制兩類增變基因：一類是DNA聚合酶的各個基因一類是dam基因和mut基因增變基因（mutatorgene）當(dāng)生物體內(nèi)有些基因突變時，整個基因組的突變頻率明顯上升。這些基因稱為增變基因增變基因的突變導(dǎo)致突變頻率的大幅提升第二章基因突變及其機(jī)制在大腸桿菌中，到目前為止已發(fā)現(xiàn)有5種DNA聚合酶，分別為DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，都與DNA鏈的延長有關(guān)。DNA復(fù)制中起主導(dǎo)作用的是DNApolⅢ[1]聚合作用：[2]3'→5'外切酶活性──校對作用：[3]5'→3'外切酶活性──切除修復(fù)作用拓展閱讀：DNA聚合酶第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制突變的獨立性一個基因的突變不受其它基因突變的影響，兩個不同基因同時發(fā)生突變的頻率為兩個基因各自的突變率的乘積。交叉抗性產(chǎn)生原因：作用2種或以上結(jié)構(gòu)類似的抗生素或作用機(jī)制近似抗生素，從而表現(xiàn)為交叉抗性。拓展閱讀：抗生素的抗性機(jī)理第二章基因突變及其機(jī)制自發(fā)突變的頻率可以通過某些理化因素的處理而大為提高。高幅度為101~105倍基因突變的可誘發(fā)性是誘變育種的基礎(chǔ)突變的可誘導(dǎo)性突變基因和野生型基因一樣是一個相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，通過復(fù)制傳遞給子代DNA突變基因所表現(xiàn)的遺傳性狀也是一個穩(wěn)定的性狀突變的可遺傳性第二章基因突變及其機(jī)制突變的可逆性真正的原位回復(fù)突變，可使突變基因回復(fù)到野生型基因完全相同的DNA序列第二點的回復(fù)突變(抑制突變suppressormutation)第二點的回復(fù)突變并沒有改變突變的DNA堿基序列，只是其突變效應(yīng)被抑制了.大多數(shù)回復(fù)突變都是第二點突變抑制了第一次突變造成的表現(xiàn)型(表型抑制)第二章基因突變及其機(jī)制基因內(nèi)抑制：抑制突變發(fā)生在正向突變基因內(nèi)；基因間抑制：抑制突變發(fā)生在其他基因之中；抑制突變的類型根據(jù)作用位置分：直接抑制突變：通過恢復(fù)或部分突變基因蛋白質(zhì)的功能；間接抑制突變：通過改變其他蛋白質(zhì)的性質(zhì)或表達(dá)水平而補(bǔ)償原來突變造成的缺陷，從而使野生表型得以恢復(fù)。根據(jù)作用方式分：第二章基因突變及其機(jī)制

鑒定：重組實驗。由于抑制突變發(fā)生位置很近，鑒定困難，DNA序列分析或蛋白質(zhì)序列分析?；騼?nèi)抑制突變第二章基因突變及其機(jī)制基因內(nèi)抑制突變：

錯義突變可通過基因內(nèi)的另一處突變使蛋白質(zhì)功能得到恢復(fù)。第二章基因突變及其機(jī)制移框突變的基因內(nèi)抑制突變：可通過基因內(nèi)第二點基因插入或基因缺失使蛋白質(zhì)功能得到恢復(fù)。

SerGluThrMetPheThrAGGGAGACUAUGUUUACG野生型：GSerGluAspTyrValTyrAGCGAGGACUAUGUUUACG突變型：SerGlyThrMetPheThrAGCGGGACUAUGUUUACG去除ASerGluAspXPheThrAGGGAGGACUAGUUUACG去除U需要琥珀抑制tRNA第二章基因突變及其機(jī)制正向突變的無義突變、錯義突變和移框突變可被另一基因上的突變所抑制，分別稱為無義抑制突變，錯義抑制突變和移框抑制突變。這些突變均發(fā)生在tRNA或與tRNA功能有關(guān)的基因上，這些基因又叫抑制基因?；蜷g抑制突變第二章基因突變及其機(jī)制UAG抑制tRNA：琥珀型（amber）抑制突變UAA抑制tRNA：赭石型（Ochre）抑制突變UGA抑制tRNA：乳石型（Opal）抑制突變(1)基因間無義抑制突變溫度敏感抑制突變：許多amber突變抑制tRNA表現(xiàn)出溫度敏感性，即30℃能產(chǎn)生對amber突變表型抑制，而在42℃則不能產(chǎn)生這種效應(yīng)。第二章基因突變及其機(jī)制（2）基因間錯義抑制突變：tRNA的反密碼子的改變例如：GGA（Gly）→AGA（Arg）如果甘氨酸t(yī)RNA反密碼子也由UCC→UCU，則仍能在相應(yīng)處安插一個Gly，如果安插的不是Gly，而是其他氨基酸，只要能使蛋白質(zhì)功能部分恢復(fù)，都表現(xiàn)出錯義抑制效應(yīng)。（3）基因間移框抑制突變:tRNA反密碼子上增加或減少一個堿基。第二章基因突變及其機(jī)制第三節(jié)自發(fā)突變的機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制轉(zhuǎn)座因子（TransposableelementTE）細(xì)胞基因組中能夠從一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的一段DNA序列。幾乎所以生物都有轉(zhuǎn)座因子存在第二章基因突變及其機(jī)制轉(zhuǎn)座因子類型按照結(jié)構(gòu)和遺傳性質(zhì)分三類插入序列（insertion,IS）比較短，轉(zhuǎn)座酶基因TnP、顛倒重復(fù)序列（IR）轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）分子量較大，轉(zhuǎn)座酶基因、標(biāo)志基因（抗生素或金屬抗性基因，產(chǎn)細(xì)菌毒素基因，某些糖發(fā)酵基因）復(fù)雜轉(zhuǎn)座子、復(fù)合轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座噬菌體（Mu噬菌體，mutatorphage）沒有特定的整合位置生物誘變劑第二章基因突變及其機(jī)制DNA分子的運(yùn)動1）環(huán)出效應(yīng)2）堿基的互變異構(gòu)作用T和G可以酮式或烯醇式兩種互變異構(gòu)狀態(tài)，而C和A可以以氨基式和亞氨基式兩種狀態(tài)存在第二章基因突變及其機(jī)制5mC同樣易于自發(fā)脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏,子代DNA發(fā)生GC→AT的突變自發(fā)脫氨氧化作用胞嘧啶C氧化脫氨基自發(fā)地變成尿嘧啶U而形成錯配的堿基對第二章基因突變及其機(jī)制DNA的復(fù)制差錯源于DNA聚合酶產(chǎn)生的錯誤DNA分子運(yùn)動而造成堿基配對錯誤修復(fù)系統(tǒng)的各種缺陷所導(dǎo)致的結(jié)果第二章基因突變及其機(jī)制第四節(jié)、誘變劑及其作用機(jī)理

凡能誘發(fā)生物基因突變，并且突變頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自發(fā)突變率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)，稱為誘變劑。它們包括物理誘變劑、化學(xué)誘變劑、生物誘變劑三大類。一、物理誘變劑二、化學(xué)誘變劑三、生物誘變劑第二章基因突變及其機(jī)制一、物理誘變劑

物理輻射可分為電離輻射和非電離輻射，電離輻射是一切能引起物質(zhì)電離的輻射總稱;帶電粒子有α粒子、β粒子、質(zhì)子，不帶電粒子有中子、X射線、γ射線。非電離輻射是指能量比較低，并不能使物質(zhì)原子或分子產(chǎn)生電離.紫外線、紅外線、激光、微波都屬于非電離輻射。第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制輻射種類放射源性質(zhì)能量范圍危險性透過組織的深度X射線X光機(jī)電離輻射通常為50~300kV危險，有穿透力幾毫米至許多厘米γ射線放射性同位素及核反應(yīng)與X射線相似達(dá)幾百萬eV危險，有穿透力＞1cm中子，包括：快中子、慢中子、熱中子核反應(yīng)堆或加速器不帶電子的粒子從小于1eV到幾百萬eV危險性高，穿透力強(qiáng)＞1cmβ粒子，快速電子或陰極射線放射性同位素或加速器電子（帶“+”或“-”）幾百萬eV有時有危險＜1cmα粒子放射性同位素氦核，電離密度大幾百萬eV照射內(nèi)很危險＜1cm第二章基因突變及其機(jī)制(一)電離輻射

電離輻射：當(dāng)量子能量達(dá)到120eV以上時,對物體有電離作用,能導(dǎo)致機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p傷,這類輻射稱為電離輻射

常用于微生物誘發(fā)突變的電離輻射有快中子、X射線和γ射線等。第二章基因突變及其機(jī)制電離輻射的作用機(jī)制還不能做出圓滿解釋。存在兩種假說，即所謂的直接物理作用假說與間接化學(xué)作用(輻射裂解水分子產(chǎn)生自由基而起作用)假說。電離輻射主要引起DNA上的基因突變和染色體的畸變；1、電離輻射的作用機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制2、電離輻射的劑量快中子的劑量通常以拉德（rad）表示在誘變育種中快中子照射的致死率達(dá)到50%-85%比較合適，采用的誘變劑量大約在15-30krad（千拉德）。不同種類菌種最適當(dāng)劑量范圍是不同的。1rad=100erg/g=0.01J/kg=0.01Gy。第二章基因突變及其機(jī)制X射線和γ射線的劑量通常以倫琴(R)來表示由于X射線和γ射線穿透能力很強(qiáng)，對細(xì)胞致死作用比紫外線和一般的化學(xué)誘變劑表現(xiàn)更為強(qiáng)烈，因此，它們不適宜像紫外線那樣進(jìn)行反復(fù)多次照射。一般常用的劑量掌握在殺菌率90％-99.9％為宜，切忌用高劑量進(jìn)行處理。1cm3干燥空氣征0℃，1.013×105Pa(760mmHx氣壓下)產(chǎn)生2.08x109離子時所需的能量。第二章基因突變及其機(jī)制

直接對平皿上生長的菌落進(jìn)行照射，或者用直徑6-10mm的打孔器把菌落連瓊脂一同取出，置于滅菌平皿內(nèi)進(jìn)行照射；也可制成菌懸液，取1-2mL置于試管內(nèi)并浸入冰水中，從上或側(cè)面或下向進(jìn)行短時間照射。試管內(nèi)的菌懸液不宜過多，否則液層太厚，氧氣供給不足，誘變效應(yīng)和重復(fù)性都將比較差。處理完畢后，把盛有菌體細(xì)胞的試管繼續(xù)冰浴2-3h。低溫可降低或抑制修復(fù)酶的活性，防止突變體因修復(fù)酶的修復(fù)而還原為正常細(xì)胞。這一操作除用于γ射線外，也可用于紫外線和其他化學(xué)誘變劑，可以獲得同樣的效果3、電離輻射的照射方法第二章基因突變及其機(jī)制

非電離輻射：當(dāng)量子能量小于120eV的不足以引起生物體電離的電磁輻射，稱為非電離輻射

常用于微生物誘發(fā)突變的非電離輻射有：

(1)射頻輻射。射頻輻射稱為無線電波,量子能力很小。按波長和頻率,射頻輻射可分成高頻電磁場、超高頻電磁場和微波

3個波段。

(2)紅外線輻射。

(3)紫外線輻射。（二）非電離輻射第二章基因突變及其機(jī)制非電離輻射主要導(dǎo)致形成嘧啶二聚體。同一種輻射線對不同微生物的效應(yīng)不一樣，這與每種微生物修復(fù)系統(tǒng)的強(qiáng)弱有關(guān)。它們引起微生物的變異或死亡與輻射劑量成正比。1、非電離輻射的作用機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制2、紫外線的作用機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制(1)紫外線的有效光譜紫外線的光譜范圍在40-390nm，能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長范圍是200-300nm。最有效的波長為253.7nm。一般用來滅菌消毒的30W紫外燈管，光譜分布范圍廣，較平均，誘變效率較差。而15W紫外燈管，放射出來的紫外線大約有80%波長集中在253.7nm，因此誘受效應(yīng)比30W的好。3、紫外線誘變的方法第二章基因突變及其機(jī)制(2)紫外線的輻射劑量用于微生物誘變的紫外線劑量的表示方法，可分絕對劑量和相對劑量。絕對劑量需要用一種劑量儀來測定，由于操作比較困難，在誘變育種的實際工作中不常被采用。相對劑量單位用照射時間或者殺菌率表示。根據(jù)育種工作者長期的研究和實踐經(jīng)驗，一般認(rèn)為殺菌率以90%-99.9%效果較好。但也有報道，認(rèn)為較低的殺菌率有利于正突變菌株的產(chǎn)生，以70%-80%或更低的殺菌率為好。

第二章基因突變及其機(jī)制

紫外線照射劑量與殺菌率在一定范圍內(nèi)成正比，劑量越高，殺菌率也越高，在殘存的細(xì)胞中變異幅度也廣；反之劑量越低，殺菌率也越低，在殘存細(xì)胞中變異幅度也小。因此，在照射過程中可加大劑量，但又要采取減少死亡率和提高誘變效果的措施。使用誘變效果好的低功率15W紫外燈管2支，并安裝在放光的燈罩內(nèi)，使253.7nm光波集中到被處理的微生物細(xì)胞上，可以提高變異率。另一種辦法是把照射劑量提高到超致死量的程度，與可見光交替進(jìn)行，利用光修復(fù)使損傷的細(xì)胞恢復(fù)，減少死亡率，增加變異幅度。一般采用30W紫外燈管，光復(fù)活的效果較好，或者在預(yù)培養(yǎng)基中增加一定量的咖啡因或蛋白陳，也可以降低此亡率。第二章基因突變及其機(jī)制(3)紫外線誘變的步驟與方法：1)出發(fā)菌株，把細(xì)菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期，霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟。2)前培養(yǎng)，對細(xì)菌類以肉湯為主，適量加入核酸類物質(zhì)或酵母膏等制成營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，同時還可加入抑制修復(fù)的物質(zhì)，如咖啡堿或異煙胺等。將菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài)(對數(shù)期)，約16-24h；霉菌、放線菌培養(yǎng)到絕大部分孢子剛剛萌發(fā)。第二章基因突變及其機(jī)制3)制備菌懸液，離心除去培養(yǎng)基，用生理鹽水制備菌懸液、加入玻璃珠振蕩分散，以無菌濾紙或脫脂棉過濾，使形成單細(xì)胞，分散程度達(dá)90%-95%。要求菌懸液濃度：細(xì)菌約1×108個/mL，放線菌約107-108個/mL，霉菌約106-107個/mL。第二章基因突變及其機(jī)制4)紫外線照射，取以上制備好的菌懸液3mL于直徑7cm的平底平皿中(直徑9cm平皿，約加5-6mL)。紫外燈打開預(yù)熱20min，以穩(wěn)定光波。將盛有菌懸液的平皿放到磁力攪拌器上，離燈管一定距離，打開皿蓋，暴露紫外光下照射一定時間，邊攪拌邊照射，力求使細(xì)胞均勻吸收紫外線光波。以上照射過程必須在備有黃光或紅光的暗室內(nèi)進(jìn)行，以免光修復(fù)。據(jù)國外報道，經(jīng)過紫外線誘變后的菌體(特別是細(xì)菌、放線菌)轉(zhuǎn)入到無菌試管內(nèi)，并立即浸入冰水中1-2h，在低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)參與對突變體修復(fù)的各種酶類活性受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)行，有利于提高突變率。第二章基因突變及其機(jī)制5)后培養(yǎng)，根據(jù)延遲現(xiàn)象的原理，照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體增值的培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)l.5-2h。有些微生物在增殖培養(yǎng)基中加人適量的酪素水解物、色氨酸或異煙肼等物質(zhì)，可以抑制修復(fù)，有利于突變體繁殖和減少細(xì)胞懸液在貯存過程中的死亡，能明顯提高突變率。6)稀釋涂皿，后培養(yǎng)結(jié)束后，從中取一定量培養(yǎng)物，作不同稀釋度，涂皿，并且以未經(jīng)紫外線照射過的菌懸液作對照皿，培養(yǎng)后，桃取菌落，以待篩選。第二章基因突變及其機(jī)制1、微波微波是一種電磁波，其生物學(xué)效應(yīng)分為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)。有人研究了微波誘變大腸桿菌和米曲霉的生物學(xué)效應(yīng)。在輻射過程中采用分散低溫干燥法，消除微波熱效應(yīng)的影響。發(fā)現(xiàn)微波對微生物有一定的致死能力和誘變效應(yīng)。選擇適當(dāng)?shù)膭┝亢蜆悠诽幚矸椒?，可起到較好的誘變效果。(三)其他物理誘變劑第二章基因突變及其機(jī)制2、紅外射線應(yīng)用紅外輻射和紫外輻射對果膠酶產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體和孢子進(jìn)行誘變，發(fā)現(xiàn)紅外輻射能促進(jìn)菌體代謝，提高對紫外損傷的抗性。在紫外線中增加紅外輻射可顯著提高誘變效果。紅外輻射產(chǎn)生的突變株產(chǎn)酶性能顯著高于對照親株，說明紅外輻射是有效的微生物物理誘變因子。第二章基因突變及其機(jī)制3、激光激光是一種光量子流，又稱光微粒。科學(xué)家1968年提出小劑量輻射對生物有刺激效應(yīng)的研究理論后，激光應(yīng)用于生物學(xué)領(lǐng)域的成就備受人們的關(guān)注。激光輻射可以通過產(chǎn)生閃、熱、壓力和電磁場效應(yīng)的綜合作用，直接或間接地影響生物有機(jī)體。引起DNA、染色體畸變效應(yīng)，酶的激活和鈍化以及細(xì)胞的分裂和細(xì)胞代謝活動的改變等。除紫外波段的激光有誘變作用外，可見光~紅光波段間的激光也有誘變作用。曾有人用激光照射棉病囊霉引起突變而產(chǎn)生核黃素，對釀酒酵母AS2.1189進(jìn)行CO2激光誘變育種，發(fā)現(xiàn)對酵母菌乙醇代謝的改變有刺激效應(yīng)。目前激光成為微生物的常用誘變劑。第二章基因突變及其機(jī)制4、高能電子流高能電子流是較強(qiáng)的電離輻射線，在抗生素菌種選育中都采用這種誘變劑，普遍接受的誘變劑量為殺菌率90%-99.9%。在林可霉素產(chǎn)生菌林可鏈霉菌的誘變育種工作中，采用高能電子流誘變時，70%-90%的殺菌率為最佳劑量。用高能電子輻射果膠酶產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體進(jìn)行誘變，選出變異株，產(chǎn)酶性能顯著優(yōu)于親株。第二章基因突變及其機(jī)制5、離子注入離子注人是20世紀(jì)80年代初興起的一種材料表面處理的高新技術(shù)，主要用于金屬材料表面的改性。1986年被用于農(nóng)作物育種，現(xiàn)在逐漸應(yīng)用于多種農(nóng)作物。所謂離子注入誘變，就是利用離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)的改變，導(dǎo)致性狀的變異，從而達(dá)到育種的目的。離子注人法作為一項新的生物誘變技術(shù)而引起國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。離子注人和其他常規(guī)誘變及化學(xué)誘變過程有明顯的差異。其他輻射誘變僅僅是利用能量的交換，化學(xué)誘變劑也只是分子基團(tuán)的交換，而離子注入在誘變生物學(xué)效應(yīng)上有著明顯的優(yōu)點：第二章基因突變及其機(jī)制

我國1994年報道了離子注入鏈霉菌的誘變效應(yīng)，證明離子注入法的高突變率，獲得26.73%的正突變率。1995年又有報道指出，采用N+和C4+注入核糖霉素產(chǎn)生菌、卡那霉素抗性產(chǎn)生菌時，其中以N+的誘變效果最顯著。1997年，又有報道N+注入紅霉素產(chǎn)生菌的誘變效應(yīng)，認(rèn)為離子注入產(chǎn)生的自由基對生物效應(yīng)基本上無影響。離子注入右旋糖酐產(chǎn)生菌，得到產(chǎn)量提高36.5%的變株。有關(guān)離子注入的誘變機(jī)制研究工作仍在進(jìn)行，它是一類高效、方便、安全無污染的新型誘變源，將引起越來越多的育種工作者的重視。第二章基因突變及其機(jī)制二、化學(xué)誘變劑

化學(xué)誘變劑是一類能對DNA起作用、改變其結(jié)構(gòu)、并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)?；瘜W(xué)誘變劑主要包括四大類：堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑以及其他種類等?；瘜W(xué)誘變劑的作用機(jī)制都是與DNA起化學(xué)作用，誘變效應(yīng)和它們的理化特性有很大關(guān)系，使用前必須認(rèn)真了解和掌握。這些化合物的穩(wěn)定性以及影響其穩(wěn)定性的條件，如溫度、光照、pH的影響、化合物的半衰期以及與溶劑或增溶劑是否起反應(yīng)等第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制使用化學(xué)誘變劑時應(yīng)注意：絕大多數(shù)化學(xué)誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質(zhì)或極毒藥品，使用時要格外小心，不能直接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全防止污染環(huán)境，造成公害。

化學(xué)誘變劑的劑量主要決定于其濃度和處理時間。在進(jìn)行化學(xué)誘變處理時，控制使用劑量要以誘變效應(yīng)大、而副反應(yīng)小為原則。處理時的溫度對誘變效應(yīng)也有一定影響。第二章基因突變及其機(jī)制（一）堿基類似物

堿基類似物是一類和天然的嘧啶嘌呤等四種堿基分子結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，是一種既能誘發(fā)正向突變，也能誘發(fā)回復(fù)突變的誘變劑。用于誘發(fā)突變的堿基類似物有5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-溴脫氧尿嘧苷(BUdr)、5-碘尿嘧啶(5-IU)等，它們是胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)類似物；2-氨基嘌呤(AP)、6-疏基嘌呤(6-MP)是腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物。最常用的堿基類似物是5-BU和AP。第二章基因突變及其機(jī)制APAG第二章基因突變及其機(jī)制5-溴尿嘧啶(5-BU)誘變機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制

由于5-BU的誘變作用是在DNA復(fù)制過程中實現(xiàn)的，因此，處在靜止或體眠狀態(tài)的細(xì)胞是不適合的。細(xì)菌采用對數(shù)期的細(xì)胞，霉菌、放線菌采用孢子，但要進(jìn)行前培養(yǎng)，使孢子處于萌動狀態(tài)，并要加大5-BU的濃度，處理過程要進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。從以上5-BU的互變異構(gòu)可以看出，它們誘變作用是通過本身分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生酮式→烯醇式的變化而實現(xiàn)的。酮式和烯醇式這種互變異構(gòu)是普遍存在的，在DNA分子中的胸腺嘧啶和鳥嘌呤也同樣會發(fā)生這種互變異構(gòu)現(xiàn)象。第二章基因突變及其機(jī)制2-氨基嘌呤(AP)誘變機(jī)制容易誘發(fā)AT→GC的轉(zhuǎn)換第二章基因突變及其機(jī)制（二）烷化劑

烷化劑是誘發(fā)突發(fā)中一類相當(dāng)有效的化學(xué)誘變劑，這類誘變劑具有一個或多個活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個或多個堿基起烷化反應(yīng)，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變。單功能烷化劑：亞硝基類、磺酸酯類、硫酸酯類、重氮烷類和乙烯亞胺等功能烷化劑：硫芥子類與氮芥子類等。烷化劑分單功能烷化劑和雙功能或多功能烷化劑兩大類。第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制

前者僅一個烷化基團(tuán)，對生物毒性小，誘變效應(yīng)大。后者具有兩個或多個烷化基團(tuán)，毒性大，致死率高，誘變效應(yīng)較差。主要原因是雙功能烷化劑(如硫芥、氮芥)的兩個烷化基團(tuán)特異地和DNA鳥嘌呤起反應(yīng)，很容易在相對DNA鏈之間形成共價鏈而產(chǎn)生交聯(lián)現(xiàn)象，妨礙雙鏈完全分開，影響DNA復(fù)制，最后導(dǎo)致生物細(xì)胞的死亡。當(dāng)然雙功能烷化劑除了交聯(lián)反應(yīng)外，也具有單功能的烷化作用。第二章基因突變及其機(jī)制1、烷化劑的作用機(jī)制烷化劑主要是通過烷化基團(tuán)使DNA分子上的堿基及磷酸部分被烷化堿基中容易發(fā)生烷化作用的是嘌呤類胸腺嘧啶O4腺嘌呤N2腺嘌呤N3胞嘧啶N3第二章基因突變及其機(jī)制通過對鳥嘌呤N7位點的烷化而導(dǎo)致突變有三種可能：烷化嘌呤引起堿基配對錯誤，脫嘌呤作用，鳥嘌呤的交聯(lián)作用第二章基因突變及其機(jī)制

烷化劑的誘變機(jī)制比較復(fù)雜，有的尚未完全弄清，但是堿基轉(zhuǎn)換引起錯誤配對，是造成基因突變的主要原因。烷化劑的誘變效應(yīng)也很復(fù)雜，它們能夠誘發(fā)DNA多種突變，且形成各種突變類型。其中某些誘變劑誘變效應(yīng)很高，稱為超級誘變劑，如亞硝基胍等。第二章基因突變及其機(jī)制

烷化劑的性質(zhì)比較活潑，不太穩(wěn)定，在水溶液中容易發(fā)生水解。因此，化學(xué)誘變劑要現(xiàn)用現(xiàn)配。不少烷化劑見光后，容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，和水解作用一樣，有的分解產(chǎn)物會失去誘變作用或具有毒性。因此，保藏時要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。另外，配制烷化劑溶液時，要采用合適的pH緩沖液。第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制

一般烷化劑殺菌率低而誘變效應(yīng)高，如亞硝基類、磺酸酯類等。但烷化劑多數(shù)極毒，能致癌，所以無論在配制藥品、誘變操作及誘變后器皿處理時，都要小心謹(jǐn)慎，注意安全，避免直接接觸身體以及防止污染環(huán)境。下面介紹幾種常用的烷化劑：第二章基因突變及其機(jī)制2、1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍(簡稱亞硝胍，NTG，NG或NG或MNNG)第二章基因突變及其機(jī)制

亞硝基胍為黃色結(jié)晶狀物質(zhì)，性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光易分解，放出NO，顏色由黃色變?yōu)榫G色，誘變效應(yīng)降低。須保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低溫條件下貯存。NTG不溶于水，須加助溶劑，使用時現(xiàn)配現(xiàn)用。

NTG有超誘變劑之稱，能使細(xì)胞發(fā)生一次或多次突變，誘變效果好，尤其適合于誘發(fā)營養(yǎng)缺陷型突變株。其中處理細(xì)菌、放線菌等微生物時，不經(jīng)淘汰，就可以直接得到10%以上的營養(yǎng)缺陷型突變株，而用一般誘變劑處理只能達(dá)百分之幾至千分之幾。NTG還能使多基因并發(fā)突變，在復(fù)制叉附近一個基因突變能誘發(fā)鄰近位置的基因陸續(xù)連鎖突變。第二章基因突變及其機(jī)制NTG在水溶液中隨著不同的pH將產(chǎn)生不同的分解產(chǎn)物，從而影響誘變效應(yīng)。當(dāng)溶液pH低于5.5時，NTG分解成HNO2，HNO2自身就具誘變作用；當(dāng)溶液pH在8.0以上時，NTG會分解產(chǎn)生重氮甲烷(CH2N2)，對核酸起烷化作用，引起微生物突變；當(dāng)溶液pH為6.0時，NTG本身和DNA起烷化反應(yīng)而導(dǎo)致突變。通常在pH6.0的條件下進(jìn)行誘變處理。由于酸堿條件影響NTG的誘變效果，因此，無論是配制NTG溶液，還是制備菌懸液都要用適宜的緩沖溶液。常用的有磷酸緩沖液和Tris緩沖液。第二章基因突變及其機(jī)制NTG的誘變處理方法：①取新鮮的斜面，用一定pH值的磷酸緩沖液或Tris緩沖液洗下細(xì)菌作成菌懸液。如果采用細(xì)菌細(xì)胞或絲狀菌孢子(真菌或放線菌)須進(jìn)行前培養(yǎng)，可用有關(guān)培養(yǎng)基代替以上緩沖液，孢子培養(yǎng)時間控制在大部分孢子處在萌動階段，經(jīng)離心、洗滌，則可用緩沖液制成懸液，濃度約在106-107/mL；②配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶劑甲酚胺或丙酮少許，然后加緩沖溶液，其比例為9：1(緩沖溶液9mL：NTG丙酮溶液1mL)，一般NTG母液濃度配成lmg/mL。使用時取母液0.2mL，加菌懸液1.8mL，NTG最后處理濃度為100ug/mL。一般處理濃度隨菌種不同而異，通常細(xì)菌為100-1000ug/mL，而放線菌、真菌孢子為1000-3000ug/mL。第二章基因突變及其機(jī)制③混合保溫，將以上菌懸液和NTG溶液盛于一試管內(nèi)，置該菌生長適宜的溫度下保溫(細(xì)菌30-35℃、真菌25-28℃、放線菌30-32℃)處理若干時間，一般細(xì)菌為20-60min，孢子90-120min。④終止反應(yīng)：用冷的生理鹽水稀釋到50倍以上或在低溫下進(jìn)行離心洗滌，除去藥液，加無菌水使沉淀懸浮并作成一定稀釋度，分離于平皿。如果是細(xì)菌，把后培養(yǎng)基按一定濃度加入到菌體沉淀物中振蕩培養(yǎng)1.5-2h，經(jīng)2-3次細(xì)胞分裂，把表型穩(wěn)定的突變細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋分離到平皿上。

處理完畢后，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡處理。NTG除以上直接以溶液處理外，還可以按以下方法誘變處理。第二章基因突變及其機(jī)制搖瓶振蕩處理：在接菌后的培養(yǎng)基中加入5-10ug/mLNTG，并加幾滴吐溫80或吐溫60，使成乳化狀(注意吐溫對該菌生長是否有影響)；在平皿上生長過程處理：如果將NTG、瓊脂和菌體混合制成平板,NTG濃度為l0-50ug/mL?；?qū)傊囵B(yǎng)基制成平板，然后將NTG和菌體混合涂抹平板，此時NTG濃度為10-20ug/mL。第二章基因突變及其機(jī)制

經(jīng)過培養(yǎng)的培養(yǎng)液，除部分進(jìn)行平板分離外，剩余的培養(yǎng)液可以加入適量的藥物，保存于冰箱內(nèi)數(shù)天。如日本有人把經(jīng)過NTG處理后的大腸桿菌培養(yǎng)液，用50%甘油水溶液加入1/3容積(最終濃度為12.5%)于-40℃、-80℃保存。在以后數(shù)天內(nèi)隨時可取出融化，稀釋分離，突變體死亡很少。如果要把培養(yǎng)液直接置冰箱保存，通過試驗確定一種適合低溫保存的培養(yǎng)基，使它們在保存期間總菌數(shù)的死亡率和正突變體的死亡率都降低到最小值。第二章基因突變及其機(jī)制

無論是用輻射線處理，還是用化學(xué)誘變劑處理后的菌懸液或后培養(yǎng)液，浸在冰水浴中2-3h，試驗的重復(fù)性很好。認(rèn)為在大腸桿菌、枯草桿菌和放線菌等可以采取這一措施來提高誘變效果。

NTG是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例如用自來水大量沖洗或用1-2mol/L的Na0H或2%的Na2S2O3浸泡過夜，洗凈。第二章基因突變及其機(jī)制3．硫酸二乙酯(DES)DES是無色的液體，不溶于水，溶于乙醇，具一定毒性，很不穩(wěn)定。DES在水溶液中半衰期很短，20℃時為3.3h，30℃時為lh，40℃時僅0.3h。因此，要嚴(yán)格做到隨用隨配，并且要低溫、干燥、避光保存。

DES誘變效應(yīng)同樣受酸堿條件的影響，pH中性時效應(yīng)最好，配制溶液和制備菌懸液都要用0.1mol/LpH7.2的磷酸緩沖液。第二章基因突變及其機(jī)制DES的處理方法：(以處理濃度1%為例)①取DES原液0.4mL于滅菌試管中，加入少量乙醇使其溶解，再加進(jìn)pH7.2的磷酸緩沖液19.6mL，配成體積分?jǐn)?shù)為2%的溶液；②用同一種磷酸緩沖液將新鮮斜面的細(xì)菌或真菌孢子洗下，制成菌懸液，含菌密度107-108/mL；③取以上DES溶液和菌懸液等量(如5:5)加入到無菌試管內(nèi)混合，最后處理濃度為1%，在一定的溫度下，振蕩處理20-60min；④誘變處理結(jié)束加人生理鹽水稀釋，或加入Na2S2O30.5mL終止反應(yīng)。如果是細(xì)菌．將20mL肉湯培養(yǎng)基加入到以上菌體沉淀物中，進(jìn)行1.5-2h后培養(yǎng)，然后稀釋、分離于平皿。第二章基因突變及其機(jī)制

移碼誘變劑與DNA相互結(jié)合引起堿基增添或缺失而造成突變。它們主要包括吖啶黃、吖啶橙、原黃素(2,8-二氨基吖啶)等化合物。移碼誘變劑對噬菌體有較強(qiáng)的誘變作用，尤其是對噬菌體T2、T4；誘發(fā)細(xì)菌、放線菌的質(zhì)粒脫落比其他誘變劑效果更為顯著。如某些產(chǎn)生抗生素的放線菌，用吖啶類處理后，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降，主要就是出于控制抗生素合成的質(zhì)粒脫落造成的。（三）移碼誘變劑溴化乙啶（EB）第二章基因突變及其機(jī)制（1）吖啶化合物的誘變機(jī)制

DNA雙鏈上的兩個堿基之間插入吖啶類化合物分子，使DNA鏈拉長，兩堿基間距離拉寬。由于這類化合物與DNA結(jié)合后，使堿基插入或缺失，在DNA復(fù)制時造成點突變以后的所有堿基都往后或往前移動，引起全體三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)錄、翻譯錯誤而突變，故稱這種突變?yōu)橐拼a突變。第二章基因突變及其機(jī)制吖啶類化合物的誘變機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制（2）吖啶黃的性質(zhì)和使用方法吖啶黃是淡黃色晶體，微溶于熱水，溶于乙醇和乙醚，不穩(wěn)定，遇光易分解，須避光保存。吖啶黃使用時，先用少許乙醇溶解，配成一定濃度的母液。通常處理方法是將它們加入培養(yǎng)基中，使最后濃度為10-50ug/mL，混合后制成平板，將處理菌懸液分離其上，適溫培養(yǎng)，在生長過程中處理。另外，還可將吖啶黃加入到培養(yǎng)液中，濃度為10-20ug/mL，在適溫條件下，振蕩培養(yǎng)過程中處理。第二章基因突變及其機(jī)制

羥胺的分子式為NH2OH(簡稱HA)，常以鹽酸羥胺形式存在(分子式為NH2OH·HCl)，為白色晶體，溶于水，不穩(wěn)定易分解，具腐蝕性，容易吸濕，放要密封、干燥保存。1、羥化劑——羥胺(四)其它化學(xué)誘變劑第二章基因突變及其機(jī)制（1）羥胺的誘變機(jī)制羥胺是具有特異誘變效應(yīng)的誘變劑，專一地誘發(fā)G：C→A：T的轉(zhuǎn)換。對噬菌體、離體DNA專一性更強(qiáng)。DNA分子上和羥胺發(fā)生反應(yīng)的堿基主要是羥化胞嘧啶上的氨基。當(dāng)羥胺濃度為0.1-1.0mol/L，pH6.0時，它專一地與胞嘧啶起反應(yīng)，而羥化后的胞嘧啶與腺嘌呤配對，引起G：C→A：T轉(zhuǎn)換。當(dāng)羥胺濃度為0.1-1.0mol/L，pH9.0時，主要與尿嘧啶反應(yīng)；在低濃度，如10-3mol/L，pH9.0時，羥胺可以與胸腺嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶起反應(yīng)。但據(jù)分析，羥胺與T、G反應(yīng)的是它的產(chǎn)物，而不是它本身。此外，羥胺有時還能和細(xì)胞中其他物質(zhì)作用產(chǎn)生過氧化氫，也具有誘變作用。根據(jù)誘變機(jī)制，羥胺不能使突變回復(fù)，即不能使A：T→G：C轉(zhuǎn)換，進(jìn)行逆向突變。第二章基因突變及其機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制

由于羥胺是誘發(fā)G：C→A：T的專一性誘變劑，因此，可以用來鑒別突變體是A：T→G：C還是G：C→A：T轉(zhuǎn)換。如果用羥胺處理突變體后，產(chǎn)生回復(fù)突變體，說明原來突變是由A：T→G：C轉(zhuǎn)換；如果羥胺誘發(fā)突變體的結(jié)果不產(chǎn)生回復(fù)突變體，說明原突變的堿基足由G：C→A：T的轉(zhuǎn)換。這種鑒別常用于堿基類似物和亞硝酸等誘變劑誘發(fā)回復(fù)突變體的堿基轉(zhuǎn)換。第二章基因突變及其機(jī)制（2）羥胺的處理方法常用濃度為0.1%-5%，可直接在溶液中處理，時間1-2h，然后分離培養(yǎng)。但一般都加到瓊脂平板或振蕩培養(yǎng)基中，然后接入孢子或細(xì)菌，在適溫下培養(yǎng)，生長過程中處理，所用濃度比直接處理時低些。第二章基因突變及其機(jī)制

當(dāng)用亞硝酸處理引起堿基脫氨基作用，由A變成H時，第一次DNA復(fù)制后次黃嘌呤不與胸腺嘧啶配對，而與胞嘧啶配對，第二次復(fù)制后A：T轉(zhuǎn)換為G：C；由C變成U時，第一次DNA復(fù)制尿嘧啶不與鳥嘌呤而與腺嘧啶互配，第二次復(fù)制后G：C轉(zhuǎn)換為A：T；當(dāng)G變成X時，與以上兩種倩況不同，黃嘌呤仍然和胞嘧啶配對。從以上誘變機(jī)制中可以看出，亞硝酸處理微生物時，可使腺嘌呤和胞嘧啶脫氨基后引起堿基A：T→G：C和G：C→A：T，因此，亞硝酸的誘變也可以發(fā)生回復(fù)突變。亞硝酸除了脫氨基作用外，還可引起DNA兩條單鏈之間的交聯(lián)作用，阻礙雙鏈分開，影響DNA復(fù)制，從而導(dǎo)致突變。2脫氨劑——亞硝酸第二章基因突變及其機(jī)制亞硝酸脫氨基作用引起誘變的機(jī)制第二章基因突變及其機(jī)制亞硝酸誘變處理方法(以處理濃度0.025mol/L為例)

孢子的處理：取孢子懸液1mL，pH4.5醋酸緩沖液2mL及0.1mol/L亞硝酸鈉溶液1mL，最后處理濃度為0.025mol/L。于25-26℃保溫10-20min，加人O.07mol/L、pH8.6的磷酸氫二鈉溶液20mL，使pH下降至6.8左右，以終止反應(yīng)。稀釋分離于平板。第二章基因突變及其機(jī)制

細(xì)菌的處理：如果是處理細(xì)菌，亞硝酸最后濃度以0.05mol/L為例：將斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)摹，適溫培養(yǎng)到對數(shù)期，將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，棄去上清液，用生理鹽水洗滌。pH4.5醋酸緩沖液和0.1mol/L硝酸鈉溶液1：1濃度加入沉淀的菌體中，使之懸浮。于35-37℃處理5-10min、加入5倍的pH8.6的磷酸氫二鈉溶液，使pH下降到6.8。取一定量進(jìn)行后培養(yǎng)l.5-2h。然后稀釋分離于平板上。在亞硝酸處理菌體或孢子時要嚴(yán)格控制好溫度，否則會影響誘變效果。第二章基因突變及其機(jī)制

用于誘變育種的金屬鹽類主要有氯化鋰、硫酸錳等。其中氯化鋰比較常用，與其他誘變劑復(fù)合處理，效果相當(dāng)顯著。氯化鋰是白色粉末，易溶于水，暴露空氣中易潮解，使用時通常加到培養(yǎng)基中。為了避免受破壞，倒平板時，當(dāng)培養(yǎng)基溫度冷卻到50-60℃時才加入制成平板，然后把細(xì)