T-TPPA 0004-2022 DPPH 法評(píng)價(jià)中藥注射劑體外抗氧化活性操作規(guī)程

ICS

11.120.01CCS

團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/TPPA

DPPH

法評(píng)價(jià)中藥注射劑體外抗氧化活性操作規(guī)程Operating

procedure

for

injection

vitro

by

DPPH

method2022-12-22

發(fā)布 2022-12-22

實(shí)施T/TPPA

0004-2022前 言.............................................................................I1

范圍............................................................................... 12

規(guī)范性引用文件..................................................................... 13

術(shù)語(yǔ)和定義......................................................................... 14

檢測(cè)原理

........................................................................... 15

材料與設(shè)備......................................................................... 25.1

........................................................................... 25.2

........................................................................... 26

實(shí)驗(yàn)方法

........................................................................... 26.1

溶液配制....................................................................... 26.2

實(shí)驗(yàn)步驟....................................................................... 37

數(shù)據(jù)處理及判定..................................................................... 47.1

吸光度變化量的計(jì)算

............................................................. 47.2

IC50的計(jì)算

..................................................................... 47.3

的計(jì)算

..................................................................... 47.4

精密度的計(jì)算................................................................... 57.5

體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)........................................................... 5天津市醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)

發(fā)布T/TPPA

0004-2022 本文件按照GB/T

1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本文件由天津天士力之驕藥業(yè)有限公司提出。本文件由天津市醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)歸口。性評(píng)價(jià)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、

現(xiàn)代中醫(yī)藥海河實(shí)驗(yàn)室、河南天地藥業(yè)股份有限公司、天津紅日藥業(yè)股份有限公司。T/TPPA

0004-2022

1范圍本文件規(guī)定了DPPH法評(píng)價(jià)中藥注射劑體外抗氧化活性的要求。本文件適用于具有自由基清除能力的中藥注射劑體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

33087 儀器分析用高純水規(guī)格及試驗(yàn)方法《中華人民共和國(guó)藥典》20203 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抗氧化

antioxidant基氧化的反應(yīng)。3.2半抑制濃度

half

inhibitory

，IC50陽(yáng)性對(duì)照或供試品的加入使反應(yīng)溶液較相同濃度的2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）控制溶液吸光度下降0.500時(shí)，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)溶液中陽(yáng)性對(duì)照或供試品的濃度。3.3相對(duì)抗氧化活性

relative

antioxidant

activity，RAA單位濃度供試品溶液使DPPH控制溶液吸光度下降與單位濃度陽(yáng)性對(duì)照溶液使DPPH控制溶液吸光度下降的比值。4 檢測(cè)原理T/TPPA

0004-2022DPPH是一種較為穩(wěn)定的、以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)DPPH乙醇溶液光吸收減弱。DPPH乙醇溶液褪色程度與其接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，由此可評(píng)價(jià)供試品清除自由基的能力，即用IC50評(píng)價(jià)抗氧化活性的大小，L-的抗氧化活性。5 材料與設(shè)備5.1 材料5.1.1

耗材a）96孔微孔板（透明平底聚苯乙烯微孔板，帶蓋板，孔容積360μL）。b）按扣蓋聚丙烯微量離心管（、5.1.2

試劑試藥a）乙醇和DPPH均為分析純。b）L-抗壞血酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。c）水為GB/T

33087

規(guī)定的儀器分析用高純水。5.2 設(shè)備電子分析天平、酶標(biāo)分析儀、漩渦混合器、暗箱。6 實(shí)驗(yàn)方法6.1溶液配制6.1.1

DPPH溶液的配制取DPPH適量，精密稱定，加乙醇適量，混合均勻，即得。臨用現(xiàn)配，遮光保存。6.1.2

DPPH控制溶液的配制精密量取DPPH溶液適量（體積同V1），加入乙醇適量（體積同V2）稀釋制成目標(biāo)濃度（濃度可以參考為每1mL含DPPH

60μg）混合均勻，即得，臨用現(xiàn)配。6.1.3

陽(yáng)性對(duì)照系列濃度溶液的配制精密稱取L-低不少于5含L-抗壞血酸20μg、μg、12.5μg、10μg和5μg臨用現(xiàn)配。6.1.4

陽(yáng)性對(duì)照系列濃度本底溶液的配制T/TPPA

0004-2022V2入乙醇（體積同V1），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得，臨用現(xiàn)配。6.1.5

陽(yáng)性對(duì)照系列濃度反應(yīng)溶液的配制V2入DPPH溶液（體積同V1），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。6.1.6

供試品系列濃度溶液的配制精密稱取或量取供試品適量，加高純水，分別制成一系列供試品溶液（至少配制由高到低不少于5個(gè)不同濃度水平，其濃度水平之比可以參考為1.50:1.25:1.00:0.75:0.506.1.7

供試品系列濃度本底溶液的配制V2乙醇（體積同V1），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。6.1.8

供試品系列濃度反應(yīng)溶液的配制V2DPPH溶液（體積同V1），混合均勻，置于暗箱反應(yīng)，即得。517nm品本底溶液的配制），定容至刻度后進(jìn)行測(cè)定。6.2實(shí)驗(yàn)步驟供試品系列濃度反應(yīng)溶液、DPPH控制溶液和空白溶液（乙醇）各200μL，分別加入至孔微孔板底部，蓋上蓋板，移入酶標(biāo)分析儀，測(cè)定517nm處的吸光度。陽(yáng)性對(duì)照和供試品系列濃度反應(yīng)溶液的吸光度建議控制在0.10~0.80之間，且相鄰濃度反應(yīng)溶液的吸光度差值應(yīng)較為均勻。暗箱反應(yīng)時(shí)間的確定，以連續(xù)2次測(cè)定反應(yīng)溶液吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不超過(guò)2%DPPHDPPH一致。T/TPPA

0004-20227 數(shù)據(jù)處理及判定7.1吸光度變化量的計(jì)算?ADPPH式：?A=（A控制–A空白）–（A反應(yīng)–A本底）……式1式中：A控制

—

DPPH控制溶液在處吸光度A空白

—

陽(yáng)性對(duì)照或供試品系列空白溶液在517nm處吸光度A反應(yīng)

—

陽(yáng)性對(duì)照或供試品系列濃度反應(yīng)溶液在517nm處吸光度A本底

—

陽(yáng)性對(duì)照或供試品系列濃度本底溶液在517nm處吸光度7.2 IC50的計(jì)算7.2.1

解釋變量的計(jì)算解釋變量（C反應(yīng)），即陽(yáng)性對(duì)照或供試品系列濃度反應(yīng)溶液中抗氧化活性物質(zhì)的濃度。VV

……式

C反應(yīng)

=

C系列

VIC50IC50

=

C系列

—

陽(yáng)性對(duì)照或供試品系列濃度溶液的濃度7.2.2

模型擬合將C反應(yīng)—?A進(jìn)行線性回歸，或者可采用非線性模型。回歸方程或非線性模型的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.98或判定系數(shù)應(yīng)不低于0.96。?A

=

a

C

+

b ……式37.2.3

IC50的計(jì)算依據(jù)式

4，計(jì)算求得

IC50

陽(yáng)?！?/p>

47.3 RAA的計(jì)算根據(jù)式

5

RAA，計(jì)算

RAA

時(shí)應(yīng)使陽(yáng)性對(duì)照和供試品的

50的單位統(tǒng)一。IC50

供

100%RAA

供IC50

供

100%

T/TPPA

0004-2022……式

5式中：IC50

陽(yáng)

—

陽(yáng)性對(duì)照的半抑制濃度IC50

供

—

供試品的半抑制濃度7.4 精密度的計(jì)算依據(jù)

6.1.8

項(xiàng)下要求制備不少于

6