流式細(xì)胞儀培訓(xùn)手冊(cè)(完成版)

流式細(xì)胞儀培訓(xùn)手冊(cè)序論學(xué)習(xí)儀器的最好方法是操作儀器，然而在理解原理的根底上進(jìn)行儀器操作無疑會(huì)起到事半功倍的作用。本書介紹了流式細(xì)胞儀的根本知識(shí)，并從不同角度詳盡闡述了各種臺(tái)式機(jī)〔FACScanTM，F(xiàn)ACSortTM，F(xiàn)ACSCaliburTM，和BDLSR〕與大型機(jī)〔FACSVantageTM，F(xiàn)ACSVantageTMSE，和FACStarPLUSTM〕之間的不同。閱讀本書有助于增強(qiáng)讀者操作儀器的動(dòng)手能力和經(jīng)驗(yàn)。目錄第1章綜述……………………4第2章液流系統(tǒng)………………第3章散射光信號(hào)及熒光信號(hào)………………3.1散射光信號(hào)………3.2熒光信號(hào)…………3.3熒光補(bǔ)償?shù)?章光電系統(tǒng)………………4.1光平臺(tái)……………4.2光學(xué)濾片………4.3信號(hào)探測(cè)器……………………4.4閾值………………第5章數(shù)據(jù)分析………………5.1數(shù)據(jù)采集及顯示…………………5.2設(shè)門………………5.3細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析…………5.4流式細(xì)胞儀其它應(yīng)用的數(shù)據(jù)分析………………5.5CellQuest軟件使用……………5.6MutiSet軟件使用………………5.7Simultest軟件使用……………5.8B27軟件使用…………………5.9WinMDI軟件使用…………5.10FACSPress軟件使用…………5.11SystemII軟件使用…………5.12MultiCycle軟件使用…………5.13Modfit使件使用……………第6章流式根本檢測(cè)工程6.1淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)〔雙色、三色、四色，三種軟件分析〕6.2B27的檢測(cè)………6.3血小板抗體檢測(cè)………………6.4網(wǎng)織血小板及紅細(xì)胞分析……6.5干細(xì)胞檢測(cè)……………………6.6DNA倍體分析……………………6.7凋亡檢測(cè)…………第7章分選6.1分選………………第8章激光器及光路校正……………………7.1激光器的工作原理………………7.2光路校正…………第9章答案………………第一章綜述流式細(xì)胞術(shù)是一項(xiàng)快速檢測(cè)分析單個(gè)粒子多物理特性的高技術(shù)，通常指細(xì)胞通過激光束時(shí)在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以及相對(duì)的熒光強(qiáng)度。通過光電系統(tǒng)記錄細(xì)胞的散射光信號(hào)和熒光信號(hào)可得知細(xì)胞特性。流式細(xì)胞儀主要由三局部組成：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；光路系統(tǒng)以及電系統(tǒng)。其作用如下：·液流系統(tǒng)：依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)。·光路系統(tǒng)：細(xì)胞由激光激發(fā)，通過光學(xué)濾片產(chǎn)生光信號(hào)，并傳送到相應(yīng)的探測(cè)器。·電系統(tǒng)：把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。對(duì)于有分選裝置的儀器，電系統(tǒng)可初始化分選條件。在流式細(xì)胞儀中，細(xì)胞被傳送到液流中的激光照射區(qū)。任何存在于懸液中的直徑為0.2-150微米的粒子或細(xì)胞都適用于流式分析。在實(shí)際工作中，用實(shí)體組織進(jìn)行流式細(xì)胞分析往往是不可能的，分析之前必須對(duì)其進(jìn)行分解。被液滴包繞的粒子稱為細(xì)胞液柱，當(dāng)粒子經(jīng)過激光照射區(qū)時(shí)，通過激光激發(fā)產(chǎn)生散射光。含有熒光的粒子就會(huì)表現(xiàn)出其熒光特性。散射光和熒光由光路系統(tǒng)〔相應(yīng)的透鏡，濾片和探測(cè)器〕收集。分光器和濾光片引導(dǎo)散射光和熒光至相應(yīng)的探測(cè)器，把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。單個(gè)粒子通過其表現(xiàn)出的光散射和熒光屬性，通過列表模式〔Listmode〕完成數(shù)據(jù)采集，并對(duì)樣本中的細(xì)胞亞群進(jìn)行分析。圖1-1散射光和激發(fā)光信號(hào)轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)可處理的充電脈沖習(xí)題：概覽1流式細(xì)胞儀可測(cè)量細(xì)胞或粒子的哪些屬性？2大多數(shù)流式細(xì)胞儀使用何種光源？3流式細(xì)胞儀的三大系統(tǒng)是什么？4哪種類型的生物樣本最適于做流式細(xì)胞分析？5液流包繞細(xì)胞形成？6帶有熒光的細(xì)胞通過激光束時(shí)，會(huì)產(chǎn)生哪兩種光信號(hào)？7由粒子激發(fā)的光由收集。8所有流式細(xì)胞測(cè)量是在單個(gè)細(xì)胞上同時(shí)進(jìn)行嗎？〔對(duì)錯(cuò)〕9在進(jìn)行流式分析之前粒子必須是單個(gè)細(xì)胞懸液嗎？〔對(duì)錯(cuò)〕第二章液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)的作用是依次傳送待測(cè)樣本中的細(xì)胞到激光照射區(qū)，其理想狀態(tài)是把細(xì)胞傳送到激光束的中心。而且在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該只有一個(gè)細(xì)胞或粒子通過激光束。因此，必須在流動(dòng)室內(nèi)把細(xì)胞注入鞘液流。流動(dòng)室是液流系統(tǒng)的核心部件，臺(tái)式機(jī)中流動(dòng)室稱為樣品槽，大型機(jī)稱之為噴嘴。在流動(dòng)室內(nèi)細(xì)胞液柱聚焦于鞘液中心，細(xì)胞在此與激光相交。流動(dòng)室內(nèi)充滿鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的約束下，細(xì)胞排成單列出流動(dòng)室噴嘴口，并被鞘液包繞形成細(xì)胞液柱。這種同軸流動(dòng)的設(shè)計(jì)，使得樣品流和鞘液流形成的流束始終保持著一種分層鞘流的狀態(tài)，這個(gè)過程稱為流體聚焦。該原理適用于所有流動(dòng)室，如圖2-1和2-2所示：圖2-1細(xì)胞液柱通過樣品槽產(chǎn)生流體聚焦，圖2-2細(xì)胞液柱通過噴嘴產(chǎn)生流體聚焦樣本壓力和鞘液壓力是不同的，且樣本壓力總是大于鞘液壓力。樣本壓力調(diào)節(jié)器通過改變樣本壓力的方法控制樣本流速?！づ_(tái)式機(jī)：單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出，粒子或細(xì)胞在流動(dòng)室內(nèi)與激光相交〔圖2-1〕。除BDLSR型臺(tái)式機(jī)有樣本壓力細(xì)調(diào)旋鈕外，大多數(shù)臺(tái)式機(jī)都采用固定的樣本壓力〔分低，中，高速〕?！ご笮蜋C(jī)：單個(gè)細(xì)胞懸液從噴嘴噴出后，粒子或細(xì)胞在流動(dòng)室外與激光相交〔圖2-2〕。且樣本壓力連續(xù)可調(diào)。增加樣本壓力就是通過加寬液柱的方法增加樣本流速。換言之，在特定時(shí)間內(nèi)，允許更多細(xì)胞通過液流。當(dāng)液柱變寬時(shí)，一些流經(jīng)激光束的細(xì)胞會(huì)偏離中心，光斑也會(huì)偏離理想角度，這在一定程度下是允許的?！じ吡魉龠m用于定性測(cè)量，如免疫表型。樣本流變寬，細(xì)胞間距離縮短，這樣在單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)量增加，可以快速獲取數(shù)據(jù)?！さ土魉俅偈箻颖玖髯冋?，單個(gè)細(xì)胞得以依次通過，這樣大多數(shù)細(xì)胞可流經(jīng)激光束的中心，細(xì)胞受激光照射的能量比擬均一，因而低流速適用于檢測(cè)分辨率要求高的實(shí)驗(yàn)，如DNA分析。為確保粒子和細(xì)胞完全通過激光束，正確調(diào)節(jié)樣本壓力對(duì)實(shí)驗(yàn)操作是至關(guān)重要的。習(xí)題：液流系統(tǒng)1流式細(xì)胞儀中液流系統(tǒng)的作用是什么？2細(xì)胞流經(jīng)激光束時(shí)影響激光照射細(xì)胞的兩個(gè)因素是什么？3在特定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)該有多少細(xì)胞流過激光束？4單個(gè)細(xì)胞懸液在內(nèi)注入。5鞘液環(huán)包樣品并使之居中的過程稱為效應(yīng)。6什么調(diào)節(jié)器可以控制細(xì)胞液柱的寬窄？7對(duì)于臺(tái)式機(jī)，樣本的固定壓力是多少。8增加樣本壓力，也就是樣本流速和液柱。9DNA研究對(duì)檢測(cè)分辨率要求較高，推薦流速為多少。10加大流速會(huì)降低檢測(cè)分辨率?！矊?duì)錯(cuò)〕11定性檢測(cè)時(shí)可使用高流速?！矊?duì)錯(cuò)〕第三章散射光信號(hào)和熒光信號(hào)的檢測(cè)上一章我們了解到粒子或細(xì)胞是如何依次通過液柱的，本節(jié)我們首先學(xué)習(xí)激光如何照射在單個(gè)細(xì)胞上的。3.1散射光信號(hào)粒子折射激光產(chǎn)生散射光信號(hào)。散射光不依賴任何細(xì)胞樣品的制備技術(shù)〔如染色〕，因此被稱為細(xì)胞的物理特性，即細(xì)胞的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。散射光與細(xì)胞膜，核膜以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的折射性、顆粒性密切相關(guān)，細(xì)胞形狀和外表形貌也對(duì)其產(chǎn)生影響。前向角散射：前向角散射〔FSC〕光與被測(cè)細(xì)胞的大小和面積有關(guān)，檢測(cè)的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向的散射光信號(hào)〔見圖3-1〕。FSC不受細(xì)胞熒光染色的影響，常用于免疫表型分析的信號(hào)處理。側(cè)向角散射：側(cè)向角散射〔SSC〕光與被測(cè)細(xì)胞的顆粒密度和內(nèi)部結(jié)構(gòu)有關(guān)，對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感〔見圖3-1〕。SSC收集與激光束正交90度方向的散射光信號(hào)。圖3-1細(xì)胞的光散射特性上述兩種信號(hào)都是來自于激光原光束，目前采用這兩個(gè)參數(shù)組合，可區(qū)分不同種類的細(xì)胞亞群，同時(shí)可獲得細(xì)胞相關(guān)的重要信息，下列圖〔圖3-2〕為FSC和SSC組成的二維散點(diǎn)圖，從圖中可以很容易把全血樣本中淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及粒細(xì)胞區(qū)分開。圖3-2FSC、SSC二維散點(diǎn)圖習(xí)題：散射光信號(hào)1什么時(shí)候會(huì)發(fā)生光散射現(xiàn)象。2光散射信號(hào)與細(xì)胞的哪些特性有關(guān)。3與激光束方向相同的光散射稱為散射。4FSC與細(xì)胞的哪些特性相關(guān)？5與激光束方向呈90度角的光散射稱為散射。6SSC與細(xì)胞的和相關(guān)。7和雙參數(shù)的組合可區(qū)分不同種類的細(xì)胞亞群。3.2熒光信號(hào)熒光物質(zhì)吸收符合其波長范圍的光能量，內(nèi)部電子受激上升到高能級(jí)。然后受激電子迅速衰落回基態(tài)，釋放過剩能量成為光子。這種能量的轉(zhuǎn)換稱為熒光。能夠激發(fā)熒光物質(zhì)的波長范圍稱為激發(fā)光譜。因?yàn)楦嗟哪芰肯脑谖辙D(zhuǎn)換而不是熒光轉(zhuǎn)換中，所以發(fā)射光波長要高于激發(fā)光波長。熒光物質(zhì)的發(fā)射波長范圍叫做發(fā)射光譜。目前的流式細(xì)胞儀大多采用氬離子激光器，因?yàn)?88nm的激光器能夠激發(fā)一種以上的熒光〔詳見第7章〕。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號(hào)愈強(qiáng)。FITC的激發(fā)光譜如圖3-3所示，488nm非常接近FITC的激發(fā)光譜的峰值，所以FITC被激發(fā)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出最強(qiáng)熒光信號(hào)，而當(dāng)FITC被其波譜范圍內(nèi)的其它波長激發(fā)時(shí)，也會(huì)檢測(cè)到熒光，但信號(hào)強(qiáng)度不會(huì)這么高。圖3-3FITC、PE、PerCP、APC染料的激發(fā)光譜如果激發(fā)光波長都是488nm，而發(fā)射光波長又不是極其接近的話，我們可以同時(shí)檢測(cè)兩種以上的熒光。如FITC和PE雙染就符合這種條件。這兩種熒光素的發(fā)射光譜如圖3-4所示。雖然PE的激發(fā)光譜的峰值不是488nm，但也足以檢測(cè)到熒光。更重要的是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光波長是530nm，PE的發(fā)射光波長是570nm。他們的發(fā)射光波長足夠遠(yuǎn)，可以使用不同的檢測(cè)器。被檢測(cè)到的熒光信號(hào)數(shù)量與粒子中標(biāo)記上的分子數(shù)量成正比。圖3-4FITC、PE、PerCP、APC染料的發(fā)射光譜圖3-5熒光標(biāo)記抗體對(duì)細(xì)胞外表抗原的特異性結(jié)合對(duì)單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，通過分析細(xì)胞外表抗原標(biāo)記確認(rèn)細(xì)胞類型〔見圖3-5〕。在細(xì)胞的混合群體中，我們使用不同的熒光染料區(qū)分細(xì)胞亞群。每個(gè)亞群的染色模式與FSC和SSC數(shù)據(jù)相結(jié)合，用于識(shí)別樣本中的細(xì)胞種類，并可以得到各細(xì)胞亞群的百分含量。而且，還可以對(duì)感興趣的細(xì)胞進(jìn)行再分選。3.3熒光補(bǔ)償使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行多色分析時(shí)，由于熒光發(fā)射光譜的重疊，需要做補(bǔ)償調(diào)整 在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行多色免疫熒光分析時(shí)，使用的不同熒光素的發(fā)射光譜有重疊現(xiàn)象，如果不對(duì)這種現(xiàn)象做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，就會(huì)導(dǎo)致某一熒光素發(fā)出的熒光被其它“錯(cuò)誤”的檢測(cè)器檢測(cè)到。這種由于補(bǔ)償問題導(dǎo)致的錯(cuò)誤，會(huì)得到假陽性的錯(cuò)誤結(jié)果，并可能在等高圖的多色分析時(shí)，得到錯(cuò)誤的細(xì)胞群體。這里，我們可以通過使用恰當(dāng)?shù)膯稳净螂p染的樣本，對(duì)補(bǔ)償加以調(diào)整，去除光譜重疊局部的影響信號(hào)，就可以準(zhǔn)確地在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞多色分析了。單克隆抗體偶聯(lián)上熒光素fluoresceinisothiocyanate〔FITC〕、R-phychoerythrin〔R-PE〕以及Cy-Chrome，就可以用來檢測(cè)某一細(xì)胞群的多種抗原特性了。在做這樣的多色分析時(shí)，使用同一波長的激發(fā)光〔488nm〕，即15毫瓦氬離子激光。FITC的發(fā)射光為綠色熒光〔峰值為530nm〕，信號(hào)被FL1檢測(cè)器檢測(cè)；R-PE的發(fā)射光為橙紅色熒光〔峰值為575nm〕，信號(hào)被FL2檢測(cè)器檢測(cè)；Cy-Chrome的發(fā)射光為紫紅色熒光〔峰值為670nm〕，信號(hào)被FL3檢測(cè)器檢測(cè)。但是，F(xiàn)ITC的發(fā)射光譜有橙紅色光，而R-PE的發(fā)射光譜也有綠色光，等等，依次類推。這些光譜的交叉重疊，會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)被相應(yīng)檢測(cè)器以外的錯(cuò)誤的檢測(cè)器探測(cè)到。因此，要使用補(bǔ)償?shù)姆椒ㄐＵ@種信號(hào)重疊導(dǎo)致的錯(cuò)誤。它通過電子補(bǔ)償?shù)姆椒?，來去除重疊信號(hào)的影響，通過電子補(bǔ)償，使檢測(cè)到的單染細(xì)胞的另外兩種熒光信號(hào)與未染色細(xì)胞的信號(hào)水平相同。 補(bǔ)償缺乏或補(bǔ)償設(shè)置不當(dāng)，都會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果或人為造成直方圖的偏移。例如，在多色分析中，如果熒光染色細(xì)胞的補(bǔ)償設(shè)置缺乏，就可能在雙色等高圖上顯示出一個(gè)假的雙陽性群體，導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析失誤。在三色熒光分析時(shí)，為了防止由于補(bǔ)償造成的錯(cuò)誤，應(yīng)該使用單染細(xì)胞調(diào)整補(bǔ)償〔另外兩種熒光為陰性對(duì)照〕，即用每一個(gè)熒光抗體單染細(xì)胞，然后調(diào)整每兩種顏色之間的補(bǔ)償。雙色分析時(shí)，可以使用兩個(gè)互斥的單陽性抗體，通過兩種單陽性細(xì)胞群體和雙陰性群體來調(diào)整補(bǔ)償。為了使測(cè)定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，并到達(dá)長期檢測(cè)儀器性能的目的，應(yīng)該每日使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球和自動(dòng)的定標(biāo)/補(bǔ)償軟件，做熒光補(bǔ)償?shù)某醪秸{(diào)整。流式細(xì)胞儀多色分析的補(bǔ)償調(diào)整步根據(jù)實(shí)驗(yàn)室要求，每日做儀器校正〔calibration/standardization〕。檢測(cè)一個(gè)未染色樣本〔自發(fā)熒光〕，調(diào)整前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC設(shè)置，使測(cè)定細(xì)胞群體顯示好，并可以按要求設(shè)門。設(shè)門后，調(diào)整自發(fā)熒光的FL1、FL2、FL3的電壓設(shè)置〔detectorsettings〕，在對(duì)數(shù)模式下，使自發(fā)熒光位于熒光直方圖的左側(cè)〔101以內(nèi)〕。比擬自發(fā)熒光和陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，保證每個(gè)熒光的陽性水平都可以按比例顯示。使用熒光抗體逐個(gè)染色〔單染〕，運(yùn)行單染樣本，調(diào)整補(bǔ)償。監(jiān)測(cè)雙色點(diǎn)圖，調(diào)整補(bǔ)償設(shè)置〔compensationsettings〕，使染色陽性細(xì)胞和未染色陰性細(xì)胞在橫軸水平，在縱軸垂直。例如，對(duì)于PE標(biāo)記的單克隆抗體染色的細(xì)胞群，上下調(diào)整FL1-%FL2的設(shè)置，使FL2陽性群體與FL2陰性群體上下垂直〔FL2vsFL1點(diǎn)圖〕；然后，使用FITC標(biāo)記的單克隆抗體染色的細(xì)胞群，左右調(diào)整FL2-%FL1的設(shè)置，使FL1陽性群體與FL1陰性群體左右水平〔FL2vsFL1點(diǎn)圖〕。然后，再依次調(diào)整第三色補(bǔ)償FL2-%FL3和FL3-%FL2。使用雙色補(bǔ)償質(zhì)控樣本，微調(diào)補(bǔ)償。用①FITC和PE單克隆抗體，②PE和Cy-Chrome單克隆抗體染色，最好使用單克隆抗體和同型對(duì)照染互斥的單陽性細(xì)胞群體?？梢詫煞N單染細(xì)胞混合，用一個(gè)樣本管進(jìn)行雙色補(bǔ)償調(diào)整〔如混合FITC和PE染色細(xì)胞〕，在缺少互斥標(biāo)記的情況下，可以使用此方法。每一種細(xì)胞群體應(yīng)位于相應(yīng)的象限。在某些流式細(xì)胞儀上，F(xiàn)L1和FL3不能直接進(jìn)行補(bǔ)償。因此，做雙色分析時(shí)，不需要做FITC/Cy-Chrome補(bǔ)償對(duì)照管。檢查三色熒光染色的細(xì)胞群，在前面的步驟里，已經(jīng)做好了補(bǔ)償，因此，這里就不需要再調(diào)整了。獲取樣本的對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管，并保存數(shù)據(jù)文件。每一個(gè)多色分析的實(shí)驗(yàn)，都需要進(jìn)行補(bǔ)償?shù)恼{(diào)整。因此，每做一種多色分析的實(shí)驗(yàn)，都要用單染和雙染對(duì)照樣本，按照3-7步做實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)整。為了減少不同試劑間的熒光條件的調(diào)整，在開始調(diào)整補(bǔ)償時(shí)，首先應(yīng)選擇各熒光通道中染色最強(qiáng)的試劑/細(xì)胞。習(xí)題：熒光信號(hào)1當(dāng)熒光物質(zhì)吸收激光能量，并釋放過剩能量時(shí)，會(huì)發(fā)射。2熒光物質(zhì)能被激光激發(fā)出熒光的波長范圍稱為。3由熒光染料發(fā)射的波長稱為。4在流式細(xì)胞儀中通常采用什么激光器。5能夠激發(fā)FITC和PE的波長是多少。6流式細(xì)胞儀最常用的兩種熒光素是和。7熒光素標(biāo)記抗體用于檢測(cè)。第四章光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)由光學(xué)激發(fā)器和光學(xué)收集器組成。光學(xué)激發(fā)器包括激光和透鏡，透鏡用于形成激光束，并使之聚焦。光學(xué)收集器那么由假設(shè)干透鏡組成，用于收集粒子發(fā)射的光束激光束相互作用，透鏡組和濾片發(fā)送激光束至相應(yīng)的光學(xué)探測(cè)器。光平臺(tái)的設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)以上功能。4.1光學(xué)平臺(tái)流式細(xì)胞儀的光平臺(tái)提供了一個(gè)固定平面，將激光源、光學(xué)激發(fā)器和收集器控制在一個(gè)固定的位置。因而臺(tái)式機(jī)的流動(dòng)室和光路是固定的，能夠保證光斑和樣本流自始至終保持恒定。圖4-1和圖4-2分別為臺(tái)式機(jī)FACSCalibur和BDLSR的光平臺(tái)系統(tǒng)。圖4-1臺(tái)式機(jī)FACSCalibur光平臺(tái)系統(tǒng)圖4-2臺(tái)式機(jī)BDLSR光平臺(tái)系統(tǒng)在大型機(jī)中，當(dāng)液流流過噴嘴時(shí)，激光束通過消色差透鏡組以最正確角度和位置截取液流。由于光斑和液流位置會(huì)發(fā)生變化，所以大型機(jī)的光路沒有臺(tái)式機(jī)穩(wěn)定，需要每日優(yōu)化。光路不正有可能導(dǎo)致粒子受激光照射的能量不均一，從而被激發(fā)出的熒光強(qiáng)度也不相同，造成測(cè)量誤差。大型機(jī)的光平臺(tái)系統(tǒng)見圖4-3。圖4-3大型機(jī)FACSVantageSE光平臺(tái)系統(tǒng)習(xí)題：光學(xué)平臺(tái)1光平臺(tái)為激光器與提供了一個(gè)固定平面。2保證所有細(xì)胞受到均一的光照強(qiáng)度的兩個(gè)必要條件是什么。3每次使用大型機(jī)時(shí)都需要進(jìn)行光路校正〔對(duì)錯(cuò)〕。4在臺(tái)式機(jī)中，固定的能夠保證激光截取的位置是不變的。4.2光學(xué)濾片當(dāng)細(xì)胞或粒子流過激光照射區(qū)時(shí)，SSC和熒光信號(hào)很弱，需要使用光電倍增管〔PMTs〕收集，而FSC信號(hào)很強(qiáng)，由光電二極管收集即可。所有信號(hào)經(jīng)由透鏡組和濾片組到達(dá)相應(yīng)的檢測(cè)器。光電倍增管〔PMTs〕檢測(cè)到的熒光信號(hào)常常是很微弱的。在光電倍增管〔PMTs〕前設(shè)置濾片可以使相當(dāng)窄的一波長范圍內(nèi)光通過，提高了熒光信號(hào)的純度和強(qiáng)度，因而每個(gè)檢測(cè)器只有一種指定波長的熒光信號(hào)進(jìn)入而被檢測(cè)，使光譜帶寬接近熒光染料的發(fā)射峰值。這種濾片稱為帶通〔BP〕濾片。如：FITC檢測(cè)器前的濾片標(biāo)志為530/30，其含義是光譜發(fā)射波長：530±15nm，或者說允許通過的波長范圍在515nm和545nm之間。BP500/50那么表示其允許通過波長范圍為475nm-525nm。流式細(xì)胞儀中常用的濾片還有長通濾片〔LP〕和短通濾片〔SP〕，長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500nm以上的光通過，而500nm以下的光吸收或返回。短通濾片與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回?！惨妶D4-4〕。分光器的主要作用是完成光的收發(fā)。二色性反射鏡就是其中一種。560短通二色性反射鏡如圖4-1所示發(fā)射560nm或小于560nm的波長〔如圖4-1所示〕。大于560nm的波長被反射。圖4-4光線通過長通濾片、短通濾片及帶通濾片的波長范圍習(xí)題：光學(xué)濾片1檢測(cè)器前放置濾片作用是什么。2帶通濾片530/30發(fā)射的波長范圍是到。3用于選擇性地通過特定波段熒光并將另一波段熒光反射至適宜的探測(cè)器中。4濾片允許特定波長及以下的光通過，而濾片允許特定波長及以上的光通過。4.3光電探測(cè)器處在液流中的粒子通過激光束時(shí)產(chǎn)生光信號(hào)，這些光信號(hào)通過光電探測(cè)器轉(zhuǎn)換成電信號(hào)〔電壓〕，然后到相應(yīng)的通道。BD流式細(xì)胞儀有兩種類型的光電探測(cè)器：光電二極管和光電倍增管〔PMTs〕。光電倍增管〔PMTs〕對(duì)光信號(hào)比光電二極管敏感，所以前者用于檢測(cè)較弱的SSC信號(hào)和熒光信號(hào)；后者用于檢測(cè)較強(qiáng)的FSC信號(hào)。粒子進(jìn)入照射區(qū)開始散射光或熒光時(shí)產(chǎn)生充電脈沖，首先光信號(hào)或光子由光電倍增管〔PMTs〕或光電二極管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，產(chǎn)生電流，電流經(jīng)由放大器，轉(zhuǎn)換成充電脈沖。當(dāng)粒子位于激光束正中時(shí)，脈沖最大，熒光最強(qiáng)。當(dāng)粒子偏離激光束時(shí)，脈沖回到基線〔如圖4-5所示〕。圖4-5充電脈沖的產(chǎn)生充電脈沖的大小取決于光電倍增管前置放大器獲得的光子數(shù)量，放大器可設(shè)置為線性放大或者對(duì)數(shù)放大〔Lin或Log〕。對(duì)數(shù)放大〔Log〕常常用于把陰性信號(hào)從微弱的陽性信號(hào)中別離出來；而線性放大〔Lin〕通常用于放大散射光信號(hào)和熒光信號(hào)。充電脈沖通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器把0-1000mV的脈沖轉(zhuǎn)換成為代表0-1,000mV通道的數(shù)值。通道數(shù)值經(jīng)由輸入輸出〔GPIO〕數(shù)據(jù)線傳送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理顯示〔見圖4-6〕。圖4-6模擬信號(hào)到數(shù)字信號(hào)的轉(zhuǎn)換過程習(xí)題：光電探測(cè)器1收集FSC光信號(hào)。2敏感度高的收集SSC光信號(hào)和熒光信號(hào)。3探測(cè)器產(chǎn)生電流，經(jīng)由放大器轉(zhuǎn)換成電壓?！矊?duì)錯(cuò)〕4模數(shù)轉(zhuǎn)換器〔ADC〕的作用。4.4閾值閾值用于設(shè)置低于該道值的信號(hào)不被處理，只有高于等于閾值道數(shù)的信號(hào)才會(huì)被送入計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。每次只能有一個(gè)設(shè)閾參數(shù)。如：對(duì)免疫表型實(shí)驗(yàn)，閾值應(yīng)設(shè)為FSC，以消除低于閾值道數(shù)的碎片。用戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置其它參數(shù)的閾值。第二個(gè)閾值適用于配有兩個(gè)激光器的臺(tái)式機(jī)。如果設(shè)置了兩個(gè)閾值，那么粒子必須同時(shí)滿足兩個(gè)閾值的要求才會(huì)被當(dāng)作信號(hào)細(xì)胞處理。習(xí)題：閾值1FSC閾值用于消除信號(hào)。2如果設(shè)置兩個(gè)閾值，細(xì)胞必須符合其中一個(gè)閾值的要求才會(huì)被當(dāng)作信號(hào)細(xì)胞處理?！矊?duì)錯(cuò)〕第五章數(shù)據(jù)分析5.1數(shù)據(jù)采集及顯示光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓脈沖后，再通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換成為計(jì)算機(jī)能夠儲(chǔ)存處理的數(shù)字信號(hào)。流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)以FSC標(biāo)準(zhǔn)格式存儲(chǔ)，該標(biāo)準(zhǔn)由“分析細(xì)胞學(xué)協(xié)會(huì)”制定。根據(jù)FSC標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)格式應(yīng)包括三個(gè)文件：樣本獲取文件，數(shù)據(jù)設(shè)置文件和數(shù)據(jù)分析結(jié)果。4參數(shù)〔FSC，SSC，F(xiàn)ITC和PE〕的單細(xì)胞分析會(huì)生成8位數(shù)據(jù)。當(dāng)單個(gè)樣品累計(jì)收集到10000個(gè)細(xì)胞時(shí)，F(xiàn)CS數(shù)據(jù)文件為80kB。數(shù)據(jù)采集存儲(chǔ)完畢后，細(xì)胞亞群可以幾種不同格式顯示。單參數(shù)如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方圖，橫軸表示熒光通道?？v軸表示在該通道內(nèi)收集到的細(xì)胞數(shù)量〔如圖5-1〕。處在同一通道的每一細(xì)胞均符合該通道的信號(hào)值，而且具有相同的信號(hào)密度。通道右側(cè)信號(hào)的熒光強(qiáng)度明顯高于左側(cè)，越靠右側(cè)熒光亮度越強(qiáng)。圖5-1流式數(shù)據(jù)分析圖雙參數(shù)可在二維散點(diǎn)圖中同時(shí)顯示，X軸顯示通道1〔FL1〕，Y軸顯示通道2〔FL2〕。3維圖通過X，Y，Z三個(gè)軸分別顯示每個(gè)通道的細(xì)胞量〔如圖5-1〕。習(xí)題：數(shù)據(jù)采集及顯示1在直方圖中橫軸和縱軸分別表示。2二維點(diǎn)圖用于顯示參數(shù)。3在CellQuest軟件中3維圖中Z軸代表。5.2設(shè)門通過設(shè)門的方法可以定義細(xì)胞亞群的區(qū)域。如：血樣本是混合細(xì)胞群，如果想單獨(dú)分析淋巴球細(xì)胞，可根據(jù)FSC或細(xì)胞大小，在FSC，SSC的散點(diǎn)圖中設(shè)門，其數(shù)據(jù)結(jié)果只反映淋巴細(xì)胞亞群的熒光特性。圖5-2全血樣本中淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析圖習(xí)題：設(shè)門1設(shè)門的方法通常用于分析樣本內(nèi)的指定細(xì)胞?！矊?duì)錯(cuò)〕5.3細(xì)胞亞群的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析包括從點(diǎn)圖中的list-mode文件中顯示數(shù)據(jù),然后統(tǒng)計(jì)點(diǎn)圖中的細(xì)胞分布情況。如前所述，分別有幾種形式的點(diǎn)圖用于顯示數(shù)據(jù)，而且可通過設(shè)門的方法區(qū)分指定的細(xì)胞亞群。如圖5-3所示，在淋巴細(xì)胞亞群周圍設(shè)門，以單獨(dú)分析或分選該亞群細(xì)胞。圖5-3選定淋巴細(xì)胞亞群設(shè)門門內(nèi)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可在隨后的圖中顯示。在下面的實(shí)例中，我們將詳盡闡述細(xì)胞亞群百分含量的不同分析方法。我們可以通過單參數(shù)直方圖，二維點(diǎn)圖和三維圖來分析結(jié)果。單參數(shù)直方圖可定位邊界，二維點(diǎn)圖可設(shè)置象限標(biāo)志。如果需要，還可以建立數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表以輸出結(jié)果。直方圖可直觀單個(gè)參數(shù)的細(xì)胞數(shù)量。陰性對(duì)照用于決定直方圖中單參數(shù)的左右邊界〔見圖5-4〕。左圖中M1為陰性對(duì)照峰。右圖中M2為CD3FITC陽性峰。圖5-4陰性對(duì)照峰M1〔NORM001〕和CD3FITC陽性峰M2〔NORM002〕圖5-5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果說明，整個(gè)事件共記錄了6000個(gè)細(xì)胞，門內(nèi)淋巴細(xì)胞2891個(gè)。其中M1〔陰性〕細(xì)胞619個(gè)，M2〔CD3陽性〕細(xì)胞2272個(gè)細(xì)胞。淋巴細(xì)胞亞群CD3陽性百分含量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：M2：2272/2891=78.59%。圖5-5直方圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果二維點(diǎn)圖以雙參數(shù)顯示結(jié)果，每個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。圖5-6為陰性對(duì)照?qǐng)D，用于設(shè)定陰性對(duì)照邊界，全圖劃分為四個(gè)象限，以區(qū)分陰性細(xì)胞、單陽性細(xì)胞以及雙陽性細(xì)胞。左下象限〔LL〕為雙陰性細(xì)胞，左上象限〔UL〕為Y軸陽性細(xì)胞〔CD19PE〕，左下象限〔LR〕為X軸陽性細(xì)胞〔CD3FITC〕，右上象限〔UR〕為雙陽性細(xì)胞〔CD19+/CD3+〕。圖5-6陰性對(duì)照組(NORM001)和CD3FITC/CD19PE雙染樣本(NORM002)如圖5-7所示，淋巴細(xì)胞亞群雙陽性細(xì)胞〔CD19+/CD3+〕的百分含量為：296/2839=10.43%。圖5-7散點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果另一個(gè)分析方法是劃定區(qū)域，也就是設(shè)門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區(qū)域〔如圖5-8所示〕；然后統(tǒng)計(jì)該區(qū)域內(nèi)指定細(xì)胞亞群的百分含量。在圖5-9中，R4門內(nèi)為CD4陽性，CD3陰性的淋巴細(xì)胞亞群，其結(jié)果為：40/2866=1.40%。圖5-8CD3FITC/CD4PE雙染樣本分析圖圖5-9CD3FITC/CD4PE雙染樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果這種方法在分析不同的供體細(xì)胞時(shí)存在一個(gè)缺陷，因?yàn)槿绻孪榷x好細(xì)胞亞群的區(qū)域或邊界，在隨后的文件中，下一個(gè)樣本的細(xì)胞亞群位置會(huì)發(fā)生變化，這就需要操作者重新調(diào)整區(qū)域或邊界位置。為防止這種情況的發(fā)生，我們采用一種稱為集群分析〔clusteranalysis〕的新方法。BD公司的MultiSETTM和AttractorsTM軟件就屬于集群分析軟件。該軟件的特點(diǎn)是會(huì)隨著整個(gè)細(xì)胞亞群的移動(dòng)而移動(dòng)，自動(dòng)變換區(qū)域或邊界到相應(yīng)的細(xì)胞亞群位置〔見圖5-10〕。圖5-10使用Attractors分析軟件時(shí)二維點(diǎn)圖的前后變化比照5.4流式細(xì)胞儀的其它應(yīng)用以及數(shù)據(jù)分析這些分析方法通常適用于計(jì)算離散細(xì)胞群的百分含量，對(duì)于分析單克隆細(xì)胞株分子是否呈陽性并不適用。因?yàn)閱慰寺〖?xì)胞株是單個(gè)細(xì)胞群，在大多數(shù)情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組，那么我們認(rèn)為其結(jié)果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細(xì)胞的表達(dá)越高，陽性率越高。如圖5-11所示，左圖為單細(xì)胞群的散射光信號(hào)，右圖為陰性對(duì)照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個(gè)峰的幾何均值分別為2，5和20〔從左至右〕。圖5-11單細(xì)胞株分析圖除檢測(cè)陽性率，幾何均值法和中位法還用于分子〔接合子〕定量分析。QuantiCALCTM軟件就是使用中值法計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。如圖5-12所示，Y軸上的圓圈代表從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取的信息，用于計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的接合點(diǎn)位數(shù)。圖5-12使用QuantiCALC軟件計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的抗體結(jié)合位點(diǎn)數(shù)我們使用ModFitLTTM軟件進(jìn)行DNA定量分析。因?yàn)镈NA峰〔G0/G1期，S期和G2M期〕不是離散的，所以我們對(duì)曲線以下的面積進(jìn)行積分，以得到每個(gè)細(xì)胞亞群的百分含量結(jié)果。圖5-13細(xì)胞周期的DNA直方圖習(xí)題：數(shù)據(jù)分析1二維點(diǎn)圖和一維直方圖的作用分別是什么？2見圖5-4和圖5-5，CD3陰性和陽性的百分含量分別是多少。3LL象限代表雙陽性細(xì)胞亞群。〔對(duì)錯(cuò)〕4見圖5-6和圖5-7，淋巴細(xì)胞〔CD3+/CD19-〕的百分含量是多少。5只能使用矩形設(shè)定細(xì)胞區(qū)域范圍。〔對(duì)錯(cuò)〕6使用區(qū)域設(shè)定法分析樣本有哪些缺乏。7防止細(xì)胞亞群移動(dòng)的分析方法是什么。8在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測(cè)陽性率。5.5CellQuest和CellQuestPro軟件使用CellQuest和CellQuestPro軟件是目前運(yùn)用最為廣泛的流式細(xì)胞儀采集及分析軟件。它運(yùn)行于蘋果電腦上，優(yōu)質(zhì)的矢量圖顯示使得操作界面特別優(yōu)美?，F(xiàn)最新的微軟公司的Vista軟件也是仿蘋果操作系統(tǒng)界面的，可想而知在使用CellQuest和CellQuestPro時(shí)的強(qiáng)大功能及視覺質(zhì)感。CellQuest和CellQuestPro軟件主安裝在BDFACSCalibur型流式細(xì)胞儀上。1．軟件數(shù)據(jù)流程在CellQuest和CellQuestPro軟件的數(shù)據(jù)流分為二個(gè)局部：方案和數(shù)據(jù)包。方案是指用戶可以建立采集或分析所需的直方圖或散點(diǎn)圖、設(shè)門并定義門與門、門與圖之間的邏輯關(guān)系?？梢允褂梅桨高M(jìn)行數(shù)據(jù)采集或分析以往已有的數(shù)據(jù)。每個(gè)采集方案分析樣本后會(huì)生成數(shù)據(jù)包，該數(shù)據(jù)包中包括了樣本中每個(gè)顆粒在各個(gè)檢測(cè)參數(shù)上的數(shù)值，格式為FCS2.0或FCS3.0。CellQuest和CellQuestPro方案文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuestPro方案文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuestPro數(shù)據(jù)文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuestPro數(shù)據(jù)文件的圖標(biāo)CellQuest和CellQuestPro軟件中還會(huì)有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實(shí)驗(yàn)條件。它只能由CellQuest和CellQuestPro軟件中還會(huì)有關(guān)于儀器設(shè)置的文件，保存所有的實(shí)驗(yàn)條件。它只能由CellQuest和CellQuestPro軟件翻開。數(shù)據(jù)包必須由方案文件翻開，無法單獨(dú)顯示，或者可由第三方軟件進(jìn)行分析，如WinMDI。2.軟件與儀器的連接流式細(xì)胞儀需要加電開啟后會(huì)向計(jì)算機(jī)發(fā)出信息，所以如要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要先開啟流式細(xì)胞儀，然后再開啟計(jì)算機(jī)。先開儀器后開計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。在蘋果菜單下點(diǎn)擊CellQuest和CellQuestPro軟件。從Aquire菜單下選擇connettocytometer。3．方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系CellQuest和CellQuestPro軟件的方案與數(shù)據(jù)相互獨(dú)立保存，數(shù)據(jù)包可以由任一方案文件進(jìn)行分析，分析后不改變數(shù)據(jù)包中的任何數(shù)據(jù)。CellQuest和CellQuestPro軟件中方案內(nèi)的直方圖或散點(diǎn)圖有三種狀態(tài)：Acquire，Analysis和Acquire-Analysis。當(dāng)圖的屬性為Acquire時(shí)，此圖只限于采集下用，即只當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)它才能顯示顆粒；當(dāng)圖的屬性為Analysis時(shí)，此圖只限于分析已保存的數(shù)據(jù)包，它不能用于采集數(shù)據(jù)。當(dāng)圖的屬性為Acquire-Analysis時(shí)，此圖即可用于采集數(shù)據(jù)也可用于分析已有數(shù)據(jù)。所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點(diǎn)圖全部設(shè)為Acquire-Analysis屬性。CellQuestProCellQuest4．方案的建立A選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)默認(rèn)情況下，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀開機(jī)后只翻開一根激光器，及五個(gè)參數(shù)供選擇使用：FS、SS、FL1、FL2、FL3。當(dāng)我們要使用第二根激光器及FL4通道時(shí)需要勾選FL4的選項(xiàng)，儀器自動(dòng)翻開633nm激光器。選擇FourColor后，儀器自動(dòng)翻開第二根激光器，且此時(shí)FL4可用。選擇FourColor后，儀器自動(dòng)翻開第二根激光器，且此時(shí)FL4可用。B,建立散點(diǎn)圖或直方圖，命名坐標(biāo)CellQuestPro軟件主要工作界面，軟件類似于Officeword的工作面，可在A4大小的頁面上進(jìn)行編輯建立各種直方圖或散點(diǎn)圖。使用工具條可以建立散點(diǎn)圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門。使用工具條可以建立散點(diǎn)圖、直方圖并在圖上設(shè)立各種門。在CellQuestPro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點(diǎn)圖就會(huì)出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuestPro軟件中，如果Inspector窗口開著的話，選中任意直方圖或散點(diǎn)圖就會(huì)出現(xiàn)該圖的屬性，其中包括有X、Y軸的參數(shù)、是否多色顯示、圖的分析或采集屬性等等。在CellQuest軟件下，需在選擇Plot菜單，選擇Format來翻開圖的屬性對(duì)話框，其中包括了關(guān)于該圖所有選項(xiàng)。建立好直方圖或散點(diǎn)圖后，我們需要對(duì)所選的參數(shù)進(jìn)行命名，如不修改軟件自動(dòng)命名為FS、SS、FL1、FL2、FL3和FL4。在菜單上選擇Acquire欄目，選擇ParameterDescription，可出現(xiàn)關(guān)于文件存儲(chǔ)和參數(shù)命名的對(duì)話框。在這個(gè)對(duì)話框中用P字母來代表每個(gè)參數(shù)，并在此對(duì)每個(gè)采集參數(shù)進(jìn)行命名，F(xiàn)L1為CD3FITC，F(xiàn)L2為CD4PE……。C,設(shè)門并建立門與圖之間的關(guān)系在工具欄上有左側(cè)幾個(gè)按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動(dòng)門。在工具欄上有左側(cè)幾個(gè)按鈕可分別矩形門、自由門、線性門、圓形門和自動(dòng)門。本處重點(diǎn)介紹Snap-To門本處重點(diǎn)介紹Snap-To門，它可根據(jù)細(xì)胞群體的分布自動(dòng)調(diào)整門的形狀適應(yīng)細(xì)胞群體。R與G的關(guān)系R是Region的首個(gè)字母，Region一般是指一個(gè)閉合形的區(qū)域，如矩形區(qū)、自由區(qū)和圓形區(qū)。區(qū)域與區(qū)域之間可以進(jìn)行邏輯運(yùn)算，如AND、OR、NOT等關(guān)系。當(dāng)區(qū)域進(jìn)行運(yùn)算時(shí)軟件引進(jìn)了算術(shù)公式的管理概念：Gate實(shí)際了個(gè)代數(shù)式，簡稱G，其運(yùn)算式默認(rèn)如下：G1=R1，或G2=R2當(dāng)我們要進(jìn)行邏輯運(yùn)算時(shí)，可變更為G1=R1ANDR2。此時(shí)G1就成了一個(gè)算術(shù)結(jié)果了。G1=R1ANDR2G2=R1NOTR2G3=R1ORR2RegionList管理門，可以重命名或刪除門。GateList是對(duì)門進(jìn)行邏輯運(yùn)算和標(biāo)識(shí)顏色的工具。建立門與圖之間的關(guān)系翻開要編輯的直方圖或散點(diǎn)圖的屬性對(duì)話框，選擇Gate選項(xiàng)，選擇門即可。D，顯示統(tǒng)計(jì)參數(shù)如何編輯這些統(tǒng)計(jì)參數(shù)選擇統(tǒng)計(jì)參數(shù)框，在Stats菜單下的EditStatistic會(huì)變得可用，點(diǎn)出后出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)參數(shù)編輯對(duì)話框。選擇任意直方圖或散點(diǎn)圖，在Stats下拉菜單下會(huì)有更種統(tǒng)計(jì)參數(shù)選項(xiàng)。對(duì)應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。如何編輯這些統(tǒng)計(jì)參數(shù)選擇統(tǒng)計(jì)參數(shù)框，在Stats菜單下的EditStatistic會(huì)變得可用，點(diǎn)出后出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)參數(shù)編輯對(duì)話框。選擇任意直方圖或散點(diǎn)圖，在Stats下拉菜單下會(huì)有更種統(tǒng)計(jì)參數(shù)選項(xiàng)。對(duì)應(yīng)于不同的圖出現(xiàn)不同的統(tǒng)計(jì)參數(shù)。5．儀器的操作當(dāng)計(jì)算機(jī)與流式細(xì)胞儀聯(lián)機(jī)后便會(huì)出現(xiàn)以下采集控制框：在有關(guān)儀器操作所有控制選項(xiàng)框都在Cytometer下拉菜單下，同時(shí)按住“蘋果”鍵及1、2、3、4便可調(diào)取所有控制框：6．文件的保存及調(diào)用實(shí)驗(yàn)或分析過程中所建的方案可以保存下來，通File下拉菜單可以保存這些方案文件：如要翻開這些分析方案只需雙建方案圖標(biāo)即可；方案可以分析以往的數(shù)據(jù)包〔前提是方案中的直方圖或散點(diǎn)圖都已定義成Acquire-Analysis屬性〕，有兩種方案翻開以往的數(shù)據(jù)：方法一：選擇直方圖或散點(diǎn)圖，翻開該圖的屬性框〔Plot->>Format〕，見下列圖：在以上紅色框標(biāo)注的地方選擇要分析的數(shù)據(jù)包。方法二：選中方案中所有的直方圖或散點(diǎn)圖，翻開Plots菜單，選擇ChangDataFile，翻開要分析的數(shù)據(jù)包。附：CellQuestPro軟件所有下接菜單5.6MutiSet軟件使用MultiSET是BD公司的一個(gè)全自動(dòng)獲取分析軟件。它使用免洗試劑〔TriTEST三色試劑或MultiTEST四色試劑〕制備標(biāo)本，可以用來做外周血的淋巴細(xì)胞及亞型分析，同時(shí)使用TruCOUTNT,可以進(jìn)行絕對(duì)計(jì)數(shù)。MulSET設(shè)門分析，用Attractor定出淋巴細(xì)胞亞型區(qū)域。Attractor具有自動(dòng)檢查細(xì)胞位置漂移的功能，并自動(dòng)居中。因此，使用Mul軟件，可以提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率和計(jì)數(shù)的精確度。MultiSET文件生成的文件類型：ScheduleDocumentFile(【DDMMYY】．Sch)：日程記錄文件。LaboratoryReportFile(【前綴】【輸入號(hào)】．Lab)：實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，PICT文件。PhysicianReportFile(【前綴】【輸入號(hào)】．Phy)：醫(yī)生報(bào)告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：總結(jié)報(bào)告，PICT文件。FlowCytometryStandard〔FCS〕DataFile〔【前綴】【輸入號(hào)】．【試管編號(hào)】〕：MultiSET軟件可以獲取或讀取的FCS2.0標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)格式..ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含標(biāo)本和試劑信息,以及每管的所有亞群結(jié)果.2.軟件與儀器的連接流式細(xì)胞儀需要加電開啟后會(huì)向計(jì)算機(jī)發(fā)出信息，所以如要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要先開啟流式細(xì)胞儀，然后再開啟計(jì)算機(jī)。先開儀器后開計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。在蘋果菜單下點(diǎn)擊MultiSET軟件(或在Dock界面上點(diǎn)擊MultiSET)..進(jìn)入MultiSETMultiSET命令菜單參數(shù)預(yù)設(shè):ExportPreferences:選擇輸出格式Tab或Comma;選擇報(bào)告哪些試驗(yàn)結(jié)果,按SelectValuestoExport.PrintingPreferences:選擇是否自動(dòng)打印實(shí)驗(yàn)室報(bào)告Laboratoryreport,醫(yī)生報(bào)告Physicianreport,總結(jié)報(bào)告Summaryreport.PannelsPreferences:預(yù)先設(shè)定試驗(yàn)工程Runafixedpanel,或任意選定試驗(yàn)工程Runanypanel.EventsPreferences:選擇獲取細(xì)胞數(shù)量.Levey-JenningsPreferences:選擇質(zhì)控統(tǒng)計(jì),每30個(gè)一統(tǒng)計(jì)(30runs),每60個(gè)一統(tǒng)計(jì)(60runs),或不統(tǒng)計(jì)(None)MultiSET運(yùn)行程序ⅰSignIn:輸入操作者、單位、實(shí)驗(yàn)室主任,登記進(jìn)入MultiSET.ⅱSetUp:建立測(cè)試要求.ⅲFACSComp:運(yùn)行FACSComp,調(diào)整儀器條件.ⅳTestPrefs:規(guī)定報(bào)告內(nèi)容.ⅴSamples:輸入標(biāo)本及病人信息.以下程序自動(dòng)運(yùn)行,由MultiSET做提示:ⅵAcquisition:標(biāo)本獲取.顯示點(diǎn)圖,以便查看標(biāo)本獲取情況.ⅶAnalysis:結(jié)果分析.顯示點(diǎn)圖,以便查看自動(dòng)分析過程.ⅷLabReport:做實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的各管結(jié)果.ⅸPhysReport:做醫(yī)生報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果及正常值范圍.ⅹSummary:總結(jié).對(duì)當(dāng)次MultiSET的所有標(biāo)本的結(jié)果做總結(jié).第一步:SignIn:MultiSET軟件的起始頁.●輸入操作者姓名,單位名稱和實(shí)驗(yàn)室主任名稱.儀器自動(dòng)顯示流式細(xì)胞儀的序列號(hào)和型號(hào).●點(diǎn)擊Accept,進(jìn)入下一工作程序.第二步:SetUp:建立測(cè)試要求●DataSource選擇數(shù)據(jù)來源.√FromDataFiles:對(duì)以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.√FromCytometer:AcquisitionandAnalysis:在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行標(biāo)本,獲得數(shù)據(jù)并分析.√FromCytometer:AcquisitionOnly:在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行標(biāo)本,獲得數(shù)據(jù)不分析.EntryLevelFileNamePrefix確定數(shù)據(jù)文件,實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,醫(yī)生報(bào)告等文件名前綴的使用.ViewReports選擇讀實(shí)驗(yàn)室報(bào)告和醫(yī)生報(bào)告的時(shí)間.AutomaticSavingOptions確定自動(dòng)保存的文件類型及保存位置.√選擇是否保存DataFiles,LaboratoryReport,PhysicianReport,SummaryReport,ExportDocument.√按Location,選擇文件保存路徑,文件默認(rèn)路徑BDFiles:MultiSETFiles:【DDMMYY】Folder(自動(dòng)生成日期目錄).目錄名確認(rèn)后,按SelectDDMMYY確定,返回SetUp界面..第三步:FACSComp:運(yùn)行FACSComp,調(diào)整儀器條件選擇LaunchFACSComp,進(jìn)行Lysenowash校正.如果當(dāng)日已做校正,那么選擇SkipFACSComp,第四步:TestPrefs:規(guī)定報(bào)告內(nèi)容選擇是否報(bào)告絕對(duì)計(jì)數(shù),是否報(bào)告正常值范圍,以及總結(jié)報(bào)告的形式.Physician’sReportChoices醫(yī)生報(bào)告的亞群選項(xiàng)ReportReferenceRanges報(bào)告正常值范圍LaboratoryReportChoices選擇實(shí)驗(yàn)室報(bào)告內(nèi)容SummaryReportID總結(jié)報(bào)告編號(hào)第五步:Samples:輸入標(biāo)本及病人信息輸入標(biāo)本名稱SampleName,標(biāo)本編號(hào)SampleID及病歷號(hào)CaseNumber.PanelName選擇每個(gè)標(biāo)本所做的工程.WBCCount如果您需要絕對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果,但不用TruCOUNT絕對(duì)計(jì)數(shù)管,您需要輸入WBC計(jì)數(shù)總量和淋巴細(xì)胞百分含量,或輸入淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)總量.注意:調(diào)用條件,翻開Cytometer→InstrumentSettings→Open(FACStation→BDFiles→InstrumentSettingsFiles→CalibFile.LNW或CalibFile如果是對(duì)以前檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,點(diǎn)擊AddSameple,添加數(shù)據(jù),進(jìn)行分析.第六步:Acquisition:標(biāo)本獲取.顯示點(diǎn)圖,以便查看標(biāo)本獲取情況第七步:Analysis:結(jié)果分析.顯示點(diǎn)圖,以便查看自動(dòng)分析過程.第八步:LabReport:做實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的各管結(jié)果.注:可以點(diǎn)擊ManualGate,此時(shí)可以更改點(diǎn)圖大小,更改坐標(biāo)軸.按照需要,調(diào)整淋巴細(xì)胞門或Attractors.第九步:PhysReport:做醫(yī)生報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果及正常值范圍.第十步:Summary:總結(jié).對(duì)當(dāng)次MultiSET的所有標(biāo)本的結(jié)果做總結(jié).5.7SimulSET軟件使用5.8HLA-B27軟件使用HLA-B27自動(dòng)軟件是BD公司的一個(gè)全自動(dòng)獲取分析軟件。它是專門用來分析人類白細(xì)胞抗原B-27基因表達(dá)與否。軟件可以自動(dòng)設(shè)門找到CD3+的T細(xì)胞群，并分析B27基因是否表達(dá)〔表達(dá)即為陽性結(jié)果，反之即為陰性〕。HLA-B27軟件為全自動(dòng)軟件，因此，使用B-27軟件，可以提高實(shí)驗(yàn)室的工作效率和精確度。.HLA-B27生成的文件類型：LaboratoryReportFile(【前綴】【輸入號(hào)】．Lab)：實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，PICT文件。SummaryReportFile〔【DDMMYY】．Sum〕：總結(jié)報(bào)告，PICT文件。.ExportDocumentFile(【DDMMYY】．Exp)：文本文件,包含標(biāo)本和試劑信息,以及每管的所有亞群結(jié)果.軟件與儀器的連接流式細(xì)胞儀需要加電開啟后會(huì)向計(jì)算機(jī)發(fā)出信息，所以如要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)需要先開啟流式細(xì)胞儀，然后再開啟計(jì)算機(jī)。先開儀器后開計(jì)算機(jī)，以確保儀器和計(jì)算機(jī)之間的正常通訊。在蘋果菜單下點(diǎn)擊FACSComp或B-27軟件(或在Dock界面上點(diǎn)擊FACSComp或B-27軟件圖標(biāo))..在FACSComp軟件中用HLA-B27beads調(diào)試儀器條件a.在Dock菜單中FACSComp軟件圖標(biāo)，點(diǎn)擊出現(xiàn)FACSComp主界面，輸入實(shí)驗(yàn)室操作人員姓名，實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)室主任以后，點(diǎn)擊Accept進(jìn)入SetUp窗口?！不蛘咴谏洗螆?zhí)行2色Calibritebeads分析后，直接點(diǎn)擊SetUp進(jìn)入SetUp界面〕。b.在SetUp窗口中選擇分析模式：選HLA-B27Calib。注意：要在確認(rèn)Lyse/Wash(LW)分析模式的結(jié)果通過的情況下，才能進(jìn)行HLA-B27beads的調(diào)試。c.輸入HLA-B27BeadsLotNumber、Suffix和HLA-B27抗體LotNumber、Suffix，點(diǎn)擊Run，進(jìn)入調(diào)試窗口。注意：HLA-B27BeadsSuffix和HLA-B27抗體Suffix分別代表了FL1PMT的調(diào)試標(biāo)準(zhǔn)和Cutoffmarker的位置，對(duì)于結(jié)果至關(guān)重要，不可弄錯(cuò)。d.點(diǎn)擊start,進(jìn)入HLA-B27窗口。e.在HLA-B27窗口：在1ml蒸餾水中參加一滴HLA-B27beads混勻后，上機(jī)。點(diǎn)擊Start，軟件開始自動(dòng)調(diào)節(jié)FSC放大器的倍數(shù)和FL1PMT的電壓，獲取結(jié)束后，調(diào)試結(jié)果會(huì)被自動(dòng)保存。f.在Summery窗口：產(chǎn)生CalibrationReport，報(bào)告中包含所有你輸入的信息，儀器當(dāng)前的設(shè)置，調(diào)試結(jié)果，F(xiàn)SC及FL1的直方圖等。調(diào)試成功后也就意味著此時(shí)的儀器條件可以直接用于HLA-B27自動(dòng)軟件分析B27基因的表達(dá)。進(jìn)入B27軟件.1B27命令菜單圖.2B27運(yùn)行程序a.SignIn:輸入操作者、單位、實(shí)驗(yàn)室主任,登記進(jìn)入B27軟件.b.SetUp:建立測(cè)試要求.c.FACSComp:運(yùn)行FACSComp,調(diào)整儀器條件。前邊已經(jīng)調(diào)試過，直接跳過進(jìn)入下一步。d.Samples:輸入標(biāo)本及病人信息.以下程序自動(dòng)運(yùn)行,由B27軟件做提示:e.Acquisition:標(biāo)本獲取.顯示點(diǎn)圖,以便查看標(biāo)本獲取情況.f.Analysis:結(jié)果分析.顯示點(diǎn)圖,以便查看自動(dòng)分析過程.g.LabReport:做實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的各管結(jié)果.h.Summary:總結(jié).對(duì)當(dāng)次B27的所有標(biāo)本的結(jié)果做總結(jié).第一步:SignIn:B27軟件的起始頁.●輸入操作者姓名,單位名稱和實(shí)驗(yàn)室主任名稱.儀器自動(dòng)顯示流式細(xì)胞儀的序列號(hào)和型號(hào).●點(diǎn)擊Accept,進(jìn)入下一工作程序.第二步:SetUp:建立測(cè)試要求●DataSource選擇數(shù)據(jù)來源.√FromDataFiles:對(duì)以前保存的數(shù)據(jù)文件做分析.√FromCytometer:在流式細(xì)胞儀上運(yùn)行標(biāo)本,獲得數(shù)據(jù)并分析.FileNamePrefix確定數(shù)據(jù)文件,實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,醫(yī)生報(bào)告等文件名前綴的使用.ViewReports選擇讀實(shí)驗(yàn)室報(bào)告和醫(yī)生報(bào)告的時(shí)間.AutomaticSavingOptions點(diǎn)擊Accept,進(jìn)入下一工作程序.第三步:Samples輸入標(biāo)本及病人信息輸入標(biāo)本名稱SampleName,標(biāo)本編號(hào)SampleID及病歷號(hào)CaseNumber.第四步:點(diǎn)擊RunTest上樣本分析單擊圖標(biāo)，上樣進(jìn)行試驗(yàn)。軟件自動(dòng)執(zhí)行Acqusition、Analysis、LabReport三個(gè)步驟，給出報(bào)告單，測(cè)試結(jié)果自動(dòng)保存。當(dāng)進(jìn)行多個(gè)樣本測(cè)定時(shí)，點(diǎn)擊進(jìn)行下一個(gè)樣本測(cè)定。第五步:LabReport:做實(shí)驗(yàn)室報(bào)告,顯示每個(gè)標(biāo)本的結(jié)果.第六步:Summary對(duì)當(dāng)次MultiSET的所有標(biāo)本的結(jié)果做總結(jié)..5.9WinMDI軟件使用WinMDI是一款免費(fèi)的流式分析軟件，全名為：WindowsMultipleDocumentInterfaceForFlowCytometry,Version2.8。它的作者是：Dr.JosephTrotter，theScrippsResearchInstitute,SanDiego,USA(Dr.Trotter‘se-mailaddress)。在以下網(wǎng)址可以下載到該軟件：://cytometry/files/products/wm28w95(1).exe該軟件運(yùn)行PC機(jī)平臺(tái)，適用于Windows2000，XP等操作系統(tǒng)，使用十分方便，可將生成的流式分析圖拷貝至office中。軟件數(shù)據(jù)流程使用WinMDI首先需要數(shù)據(jù)源，這些數(shù)據(jù)源可以來自BD、Coulter或其他各種符合FCS2.0格式的流式數(shù)據(jù)包。注：使用本軟件分析時(shí)只需要數(shù)據(jù)包，在BD儀器可以拷貝data文件，Coulter儀器上拷貝LMD文件即可。FCS2.0格式流式數(shù)據(jù)包中包含在實(shí)驗(yàn)中每個(gè)被檢測(cè)顆粒在各探測(cè)器中信號(hào)，如1號(hào)顆粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值，2號(hào)顆粒的FS、SS、FL1、FL2通道的值……。數(shù)據(jù)包中沒有關(guān)于實(shí)驗(yàn)方案的信息。所以要翻開這些數(shù)據(jù)包需要先建立分析方案，如先建立FS/SS散點(diǎn)圖，然后選擇要分析的文件；建立FL1/FL2散點(diǎn)圖，選擇要分析的文件……。在WinMDI建立的分析方案無法保存，關(guān)閉軟件方案即消失，這也是本軟件最大的缺乏之處。軟件與儀器的連接WinMDI是一款純分析型的軟件，它不與任何流式細(xì)胞儀相連接。安裝完成后在開始菜單中選擇WinMDI運(yùn)行它。安裝的過程中要注意：WinMDI安裝軟件wm28w95(1).exe是一個(gè)自解壓文件，運(yùn)行它時(shí)會(huì)在其所在目錄下生成完整的安裝包〔有很多文件，使得該目錄凌亂不堪〕，所以一定要將wm28w95(1).ex拷在一個(gè)獨(dú)立的文件下運(yùn)行。WinMDI的運(yùn)行程序安裝完成后，程序菜單中應(yīng)有WinMDI的ICONs，可點(diǎn)擊WinMDI2.8來運(yùn)行WinMDI。運(yùn)行程序：開始→所有程序→WinMDI→WinMDI2.8關(guān)閉程序關(guān)閉所有視窗，點(diǎn)擊每個(gè)窗口右上角或者從FileMenu,選擇Exit，點(diǎn)擊Yes.方案與數(shù)據(jù)的關(guān)系由于WinMDI軟件的作用是對(duì)已有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因此并沒有數(shù)據(jù)流程與采集方案，WinMDI的強(qiáng)項(xiàng)是在后期的數(shù)據(jù)分析方面。對(duì)于WinMDI可以讀取的數(shù)據(jù)，可以任意的設(shè)定方案進(jìn)行分析，而這一過程是可重復(fù)的。令人遺憾的是WinMDI并沒有提供對(duì)設(shè)定好的方案進(jìn)行保存的功能，所以操作者每次翻開數(shù)據(jù)都要重新進(jìn)行設(shè)定方案。數(shù)據(jù)的分析程序以WinMDIDisplay對(duì)話方框來開始，其中有4個(gè)選項(xiàng)。Histogram為顯示直方圖Dotplot為顯示二維散點(diǎn)圖DensityPlot為密度圖Contour為輪廓圖。對(duì)于選定圖形后，要進(jìn)行相應(yīng)的參數(shù)選擇，對(duì)于直方圖要選擇操作人員所需要的數(shù)據(jù)，而散點(diǎn)圖那么是要選擇所需要的兩個(gè)參數(shù)〔如FSC和SSC〕，以及分析細(xì)胞的數(shù)量和圖形選項(xiàng)。在對(duì)數(shù)據(jù)分析的過程中，一張圖往往是不能滿足分析的需求的。很多情況下對(duì)第一個(gè)圖形分析完了，需要分析第二個(gè)圖形，同時(shí)需要兩張圖的比照。WinMDI對(duì)此提供非常方便的功能。例如：我們已經(jīng)建立了一個(gè)FSC和SSC的散點(diǎn)圖，現(xiàn)在需要分析了以F1和F2為參數(shù)的第二張散點(diǎn)圖，這個(gè)時(shí)候我們可以單擊Display，在彈出的選項(xiàng)中選擇Dotplot。如果需要的是其他圖形，可以選擇相應(yīng)的選項(xiàng)。直方圖的的分析對(duì)于選定的區(qū)域需要設(shè)定Marker，從屏幕上方Tools，選擇MarkerTool,點(diǎn)擊直方圖以激活該圖。點(diǎn)擊峰的左右以設(shè)定Marker邊界。改變MarkerIndex為2緊靠marker1設(shè)立marker2,點(diǎn)擊OK。點(diǎn)擊直方圖，從下拉菜單項(xiàng)選擇擇Stats得到統(tǒng)計(jì)信息。點(diǎn)擊SaveAs保存統(tǒng)計(jì)結(jié)果，在filename，鍵入Test.Txt,點(diǎn)擊OK。方案的設(shè)門A.散點(diǎn)圖的設(shè)門屏幕上方的Tools工具欄，在出現(xiàn)的2DRegionstool框中選R1，并在右側(cè)的RegionStyle中選所需的類型，如“Polygon”。點(diǎn)“Creat”鍵完成選擇。(SortRect畫方形門,Ellipse畫圓形門,Polygon畫多邊形門)。QuadrantTool用于畫十字門在點(diǎn)圖中沿目的細(xì)胞群畫多邊形region，圈定目的細(xì)胞群。完成后點(diǎn)擊“OK”。如果要?jiǎng)h除R1或?qū)1進(jìn)行修改，可右擊點(diǎn)圖，選擇Regions，重選R1，Change或Delete。右擊該點(diǎn)圖，選擇“Gates”，出現(xiàn)“Logicgatetool”對(duì)話框，從對(duì)話框的“Region”中選擇所要分析的Region，并從其右側(cè)的Logic中建立需要的邏輯關(guān)系。比方我們?cè)诘诙堻c(diǎn)圖中要分析R1細(xì)胞群：從Region中選擇R1，從Logic中選“or”或”and”，完成后點(diǎn)擊OK。該圖僅顯示R1內(nèi)的顆粒。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及打印選擇需要分析的參數(shù)，如FL1FITC標(biāo)記的為Xparameter,FL2PE標(biāo)記的為Yparameter.點(diǎn)擊Gates點(diǎn)擊And[*]激活門，點(diǎn)擊OK。點(diǎn)擊FL1Vs.FL2點(diǎn)圖任意位置,可見一個(gè)下拉菜單。選擇Stats得到門內(nèi)統(tǒng)計(jì)圖，出現(xiàn)包括統(tǒng)計(jì)信息在內(nèi)的信息框。打印頁面設(shè)置從屏幕上方File，選擇FormatPrintPage。出現(xiàn)一張空白頁，我們將復(fù)制兩個(gè)點(diǎn)圖及統(tǒng)計(jì)結(jié)果至該空白頁。點(diǎn)擊FSCVs.SSC點(diǎn)圖使顏色由灰變藍(lán)激活點(diǎn)圖。點(diǎn)擊點(diǎn)圖任意位置,可見一個(gè)下拉菜單。選擇Copy。點(diǎn)擊FormatPrintPage激活窗口，從Editmenu選擇Paste?？梢奆SCVs.SSC點(diǎn)圖出現(xiàn)在該頁面上。點(diǎn)擊FL1-HVs.FL2-H點(diǎn)圖激活窗口.點(diǎn)擊點(diǎn)圖任意位置,可見一個(gè)下拉菜單。選擇Copy，點(diǎn)擊FormatPrintPage激活窗口。選擇Paste?？梢姷诙€(gè)點(diǎn)圖出現(xiàn)在該P(yáng)rintPage.頁面上。排放好兩個(gè)點(diǎn)圖，現(xiàn)在可以進(jìn)行打印，確定PrintPage窗口處于激活狀態(tài)。從FileMenu選擇PrintActive。附：WINMDI軟件主要菜單FileMenu這些指令可用來開啟、儲(chǔ)存檔案、圈選數(shù)據(jù)、以及打印。OpenFile、NextFile、PrevFile、GateFile、SaveAs、List...、ExportData、PrintActive、PrintScreen、FormatPrintPage、Record、Preferences、Exit。EditMenu這些指令可用來編輯統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的報(bào)告型式，以及選擇圖型文件輸出的型式。Undo、Cut、Copy、Paste、Delete、SelectAll、CopyGraphicsFormat、EmptyClipboard、ViewClipboard。DisplayMenu這些指令可用來開啟四種不同圖譜。Histogram、Dotplot、Densityplot、Contour、Format、RetainMarkers、ScreenStats、EditStats。5.10FACSPress軟件使用5.11SystemII軟件使用SYSTEMII軟件運(yùn)行于CoulterXL型流式細(xì)胞儀上，操作系統(tǒng)為MS-DOS，該軟件運(yùn)行穩(wěn)定功能比擬全面。因?yàn)檫\(yùn)行在DOS狀態(tài)下，與現(xiàn)在的Windows不兼容，故在圖形輸出時(shí)會(huì)比擬繁瑣。1、軟件數(shù)據(jù)流程SYSTEMII軟件數(shù)據(jù)分為兩個(gè)局部：方案和數(shù)據(jù)包。SYSTEMII中的方案僅供數(shù)據(jù)采集用。數(shù)據(jù)以LISTMODE方式保存，生成后綴為LMD的文件，可用第三方軟件進(jìn)行分析。SYSTEMII軟件自身也帶有分析模式，即LISTMODE模式，在這個(gè)狀態(tài)下可直接翻開數(shù)據(jù)包，因?yàn)長MD文件帶有采集方案的信息，故分析時(shí)數(shù)據(jù)直接顯示在原采集方案所定義的直方圖或散點(diǎn)圖中，但無法更改、新建或刪除直方圖或散點(diǎn)圖。這一點(diǎn)是該軟件最大的缺陷。2、軟件與儀器的連接開機(jī)程序開啟計(jì)算機(jī)，雙擊“XLON”圖標(biāo)，啟動(dòng)流式細(xì)胞儀。預(yù)熱30分鐘，儀器提示：InsertSampleTube。關(guān)機(jī)程序退出SYSTEMII軟件假設(shè)在DOS方式下開機(jī)，那么在C:\XL>狀態(tài)下鍵入“XLOFF”假設(shè)在WIN方式下開機(jī)，那么返回WINDOWS界面，雙擊“XLOFF”圖標(biāo)依次關(guān)閉計(jì)算機(jī)主機(jī)，打印機(jī)，電源箱開關(guān)。3、方案與數(shù)據(jù)之間的關(guān)系SYSTEMII所建立的方案只能用于采集數(shù)據(jù)，而不能用作分析。數(shù)據(jù)保存后可在LISTMODE下翻開，數(shù)據(jù)會(huì)顯示在原采集方案所構(gòu)建的圖形中，無法對(duì)圖形進(jìn)行修改，但能修改圖中的門或增加、刪除門。4、方案的建立將SYSTEMII調(diào)節(jié)至Acquirsition狀態(tài)下，所有有關(guān)數(shù)據(jù)采集、新建方案的操作都在此狀態(tài)下進(jìn)行。A.選擇參數(shù)選擇參數(shù)后，可利用屏幕右上方的UserName將所選擇的信號(hào)改成用戶需要的名稱，如將FL1LOG改為FITC于屏幕右下方用鼠標(biāo)將需要的參數(shù)點(diǎn)成黃色B.利用參數(shù)構(gòu)建直方圖用鼠標(biāo)將屏幕右上方的參數(shù)點(diǎn)亮，然后放在直方圖的X、Y軸，創(chuàng)立需要的直方圖C.設(shè)門及分析單擊鼠標(biāo)左鍵，將需要設(shè)立分析區(qū)域的直方圖放大將屏幕右下角的REGIONEDIT改為CREATE在屏幕右側(cè)選擇分析區(qū)域類型，連續(xù)點(diǎn)擊即可改變。單參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型:LIN(線性)雙參數(shù)直方圖分析區(qū)域類型：矩形(REC)任意形(AMO)十字形(QUA)另：數(shù)字形分析區(qū)域：雙參數(shù)直方圖為矩形單參數(shù)直方圖為線性利用GATING建立直方圖之間的關(guān)系見上圖,在設(shè)立分析區(qū)域的界面下，返回多張直方圖顯示狀態(tài)。選擇所要的分析區(qū)域，如A，并將其點(diǎn)亮，放在所要GATED的直方圖上方。5、儀器操作運(yùn)行待測(cè)樣本，調(diào)整以下參數(shù)PMT(光電倍增管)、電壓(Volts)、增益(Gain)、檢測(cè)速度(FlowRate)閾值(Discriminator)、顏色補(bǔ)償(ColorCompensation)選擇預(yù)先存儲(chǔ)的方案儀器提示：InsertSampleTube將陰性對(duì)照的樣本管放入樣本臺(tái)上，儀器會(huì)自動(dòng)檢測(cè)樣本管并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集利用FastSet進(jìn)行電壓的調(diào)整，DISPLAYOPTIONFASTSET用鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊FastSet，出現(xiàn)十字標(biāo)記后，將鼠標(biāo)移至所需調(diào)整的細(xì)胞群，按住左鍵進(jìn)行調(diào)整，松開左鍵后,儀器會(huì)自動(dòng)重新進(jìn)行數(shù)據(jù)采集.相應(yīng)的電壓及增益值會(huì)隨之改變。在任何條件不變的情況下，進(jìn)行樣本測(cè)試。假設(shè)為雙色以上分析，注意調(diào)整顏色補(bǔ)償調(diào)整顏色補(bǔ)償：利用FASTCOMP進(jìn)行調(diào)整DISPLAYOPTIONFASTCOMP用鼠標(biāo)點(diǎn)擊FASTCOMP將鼠標(biāo)移置所需補(bǔ)償?shù)募?xì)胞群，拖至正常位置參照前面所述判斷顏色補(bǔ)償是否正確7、文件的保存及調(diào)用文件的保存條件事先需要在采集方案中設(shè)定好：直方圖存儲(chǔ)方式SAVE/NOSAVE直方圖存儲(chǔ)方式SAVE/NOSAVE存儲(chǔ)方案重新儲(chǔ)存方案，將原方案覆蓋調(diào)用以前所分析的數(shù)據(jù)：進(jìn)入LISTMODE模式：ACQUISITIONLISTMODESELECT選擇已儲(chǔ)存的文件OKEYPLAYNEXT將文件及圖形翻開SETUPPROTOCOL可以在原有參數(shù)的根底上重新建立直方圖，設(shè)立直方圖打印方式REGION(右下角)可以重新設(shè)立分析區(qū)域，直方圖之間的關(guān)系……5.12MultiCycle軟件使用5.13Modfit使件使用培訓(xùn)人：受訓(xùn)人：培訓(xùn)情況：培訓(xùn)日期：第6章流式根本檢測(cè)工程6.1淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)〔雙色、三色、四色，三種軟件分析〕實(shí)驗(yàn)原理：人的淋巴細(xì)胞根據(jù)其生物功能和細(xì)胞外表抗原的表達(dá)可分為三大類：T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK自然殺傷細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞表達(dá)CD3；B淋巴細(xì)胞表達(dá)CD19；NK自然殺傷細(xì)胞表達(dá)CD56或CD16，并且不表達(dá)CD3。利用各種單克隆抗體與淋巴細(xì)胞外表抗原結(jié)合，再配多色熒光染料，即可以把淋巴細(xì)胞區(qū)分為各種亞型。進(jìn)面得到各亞群的比例。調(diào)試機(jī)器：軟件FACSComp。作用：除了校準(zhǔn)熒光靈敏度之外，還要調(diào)節(jié)儀器條件。在HLA-B27實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)ACSComp的所有條件都要過，才能啟動(dòng)B27自動(dòng)軟件。因?yàn)锽27檢測(cè)的是準(zhǔn)確的熒光強(qiáng)度，對(duì)靈敏度要求很高。6.1雙色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型材料BDSimultestIMKKit試劑盒，主要成分：CD3FITC/CD4PE抗體，CD3FITC/CD8PE抗體，CD3FITC/CD19PE抗體，CD3FITC/CD16+CD56PE抗體，LeucoGATE(CD45FITC/CD14PE),FACSLysingSolution,IsotypeControl(鼠IgG1FITC/IgG2aPE)其他用品準(zhǔn)備：蒸餾水、一次性FALCON管實(shí)驗(yàn)操作1、標(biāo)本采集：使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取外周血2ml。2、染色和固定細(xì)胞：取六只流式專用管，并標(biāo)記A-F。六管中分別再參加全血100ul，再在各管中分別參加熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min。在各管中參加2ml1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.300g離心5min，棄上清液PBS洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5min，棄上清液1%多聚甲醛0.5mL上機(jī)檢測(cè)〔SimultestIMKLymphocytes專用軟件也可以使用Cellquest軟件〕；分析結(jié)果；打印實(shí)驗(yàn)報(bào)告，圖：6.2三色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型材料BDCaliBRITE3熒光校準(zhǔn)微球，數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)熒光計(jì)數(shù)微球的BDTruCOUNT管。BDTriTEST熒光標(biāo)記抗體，主要成分：CD3FITC/CD4PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP抗體CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP抗體FACS〔10×〕溶血?jiǎng)┢渌闷窚?zhǔn)備：PBS、蒸餾水、一次性FALCON管實(shí)驗(yàn)操作1、用ACD抗凝采血管收集2ml外周血。2、染色和固定細(xì)胞：〔1〕取四只流式專用管，并標(biāo)記A，B、C、D?！?〕各管中分別再參加全血100ul，再在各管中分別參加熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul，充分混勻，避光孵育15min?！?〕 在各管中參加2ml1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.〔4〕 300g離心5min，棄上清液〔5〕 PBS洗滌細(xì)胞兩次，300g離心5min，棄上清液〔6〕 1%多聚甲醛0.5mL上機(jī)檢測(cè)：使用流式細(xì)胞儀，開機(jī)以后以CaliBRITE3熒光微球和FACSComp自動(dòng)軟件檢查儀器靈敏度，并自動(dòng)設(shè)定實(shí)驗(yàn)的獲取條件，然后進(jìn)入MultiSET自動(dòng)分析軟件也可以使用Cellquest軟件設(shè)置各T淋巴細(xì)胞亞群門，獲取15000個(gè)白細(xì)胞；分析結(jié)果；打印實(shí)驗(yàn)報(bào)告，圖：6.3四色熒光分析血液淋巴細(xì)胞免疫表型材料MultiTEST?IMKKit試劑盒，主要成分：CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC抗體CD3/CD16+CD56/CD45/CD19抗體FACS〔10×〕溶血?jiǎng)┢渌闷窚?zhǔn)備：蒸餾水、一次性FALCON管實(shí)驗(yàn)操作1、用ACD抗凝采血管收集1ml外周血。2、染色和固定細(xì)胞：〔1〕取兩只流式專用管，并標(biāo)記A，B。〔2〕兩管中分別再參加全血50ul〔先充分混勻〕，再在各管中分別參加熒光標(biāo)記的單克隆抗體試劑20ul并反復(fù)抽吸，充分混勻，避光孵育15min?！?〕在各管中參加450ul1*溶血素，充分混勻，避光反響10-12min.上機(jī)檢測(cè)〔MultiSET自動(dòng)軟件〕；分析結(jié)果；打印實(shí)驗(yàn)報(bào)告，圖：參考值：(來自于BD公司)6.2B27的檢測(cè)HLA-B27分析實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：HLA-B27屬于1型MHC基因。根本上表達(dá)在機(jī)體所有有核細(xì)胞上，特別是淋巴細(xì)胞外表有豐富的含量。使用熒光定量標(biāo)準(zhǔn)微球，校正HLA-B27實(shí)驗(yàn)條件后，測(cè)定樣本中T淋巴細(xì)胞HLA-B27表達(dá)水平。假設(shè)HLA-B27表達(dá)水平大于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，那么為陽性結(jié)果；假設(shè)HLA-B27表達(dá)水平低于標(biāo)準(zhǔn)微球設(shè)定MARK，那么為陰性結(jié)果。單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機(jī)檢測(cè)。FITC標(biāo)記的抗-HLA-B27與HLA-B27抗原特異結(jié)合，PE標(biāo)記的抗-CD3與人類T淋巴細(xì)胞特異結(jié)合。調(diào)試機(jī)器：在進(jìn)行HLA-B27抗原檢測(cè)之前，要用熒光微球來校準(zhǔn)儀器，包括調(diào)節(jié)FL1和FSC。軟件FACSComp1.材料與方法：1.材料ACD抗凝管，1ml外周血，溶血素，雙蒸水，PBS〔含0.1%疊氮鈉〕，1%多聚甲醛〔固定細(xì)胞用〕試劑盒介紹：Anti-HLA-B27Kit(美國BD公司；CAT:340183)。Anti-HLA-B27Kit:Anti-HLA-B27FITC/CD3PE1.5mlHLA-B-27Calibrationbeads1.5ml10XLysingSolution30ml2.方法單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機(jī)檢測(cè)。2.實(shí)驗(yàn)步驟：1.取樣采靜脈血1ml,肝素抗凝。2.染色和固定取30μl抗HLA-B27FITC/抗CD3PE抗體于試管中,參加50μl抗凝血，混勻，室溫避光孵育15min。然后參加1∶10稀釋的裂解液2ml，避光12min，待紅細(xì)胞完全溶解后，立即300g離心5min，棄上清，用PBS洗滌1次，同上離心后棄上清。參加500μlPBS重懸細(xì)胞，以備上機(jī)檢測(cè)。3.FCM檢測(cè)：先用CaliBRITEbeads和HLA-B27calibra