蛋白質(zhì)的提取與檢測

PAGEPAGE1蛋白質(zhì)的提取與檢測細(xì)胞總蛋白的提取及含量測定【基本原理】蛋白質(zhì)含量測定法是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有兩種近年普遍使用起來的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）與二辛可寧酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測定有可能得出不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。在選擇方法時應(yīng)考慮：①實驗對測定所要求的靈敏度和精確度；②蛋白質(zhì)的性質(zhì)；③溶液中存在的干擾物質(zhì)；④測定所要花費的時間。Lowry法：蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的二價銅離子絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與磷鉬鎢酸反應(yīng)并產(chǎn)生深藍色，在750nm有最大光吸收值。在一定濃度范圍內(nèi)，反應(yīng)液顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測定時需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。Bradford法：蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍G-250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕黑色變?yōu)樗{色。在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。BCA（Bicinchoninicacid）法：二價銅離子在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成一價銅離子（Biuretreaction）并與BCA相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。【試劑配制】1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：0.174gPMSF溶解于100ml異丙醇，分裝于1.5ml離心管中，-20細(xì)胞裂解液：50mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，1%TritonX-100100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）：BSA0.1g，0.15mol/LNaCl1ml，充分溶解后-20℃0.15mol/LNaCl：0.877gNaCl溶解于100ml去離子水，高溫滅菌后室溫保存。考馬斯亮藍G250溶液：考馬斯亮藍G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸100ml，加去離子水至1L。先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和去離子水，混勻后濾紙過濾，4℃保存PBS緩沖液（pH7.4）：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4?12H2O3.63g，KH2PO40.24g，溶解于900ml雙蒸水中，用鹽酸調(diào)pH值至7.4，加去離子水定容至1L，常溫保存?zhèn)溆??！静僮鞑襟E】一、細(xì)胞總蛋白的提取人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231與食道癌細(xì)胞系EC109于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)去除培養(yǎng)液后以預(yù)冷的PBS沖洗2～3遍。加入適量的預(yù)冷的裂解液后置于冰上20～30min，不時搖動。用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)，轉(zhuǎn)移將細(xì)胞碎片和裂解液至預(yù)冷的1.5ml離心管中；。4℃、12000rpm離心15min。將上清分裝至1.5ml的EP管中，-20℃5×Loadingbuffer：50%甘油，250mMTris-HCl（pH6.8），10%β-巰基乙醇，2.5‰溴酚藍，10%SDS?；靹蚝螅盅b于1.5ml離心管中，10%過硫酸胺（AP）：0.1g過硫酸胺溶解于1.0ml去離子水，4℃保存，保存時間為2四甲基乙二胺（TEMED）：分裝少量原液于棕色瓶，4℃避光30%Acr/Bic（37.5:1）：丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉雙丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入適量去離子水于37℃下充分溶解并定容至100ml，4注意：Acr/Bic均具有毒性，易吸附和積累，應(yīng)戴手套進行操作。凝膠脫色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去離子水定容至1L，室溫保存。考馬斯亮藍G250蛋白染色液：0.1g考馬斯亮藍G250溶解于100ml脫色液中，混勻后濾紙過濾去除顆粒性物質(zhì)，置于棕色瓶中室溫保存。凝膠保存液：450ml脫色液中加入50ml甘油，混勻后室溫保存。SDS濃縮膠（5%Acrylamide）配方：分離膠配方【操作步驟】一、凝膠的配制與電泳（1）凝膠配制與上樣玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。配制10%濃度的分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生，待灌入2/3的分離膠后應(yīng)立即封膠，用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.1%的SDS。膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配制5%濃度的濃縮膠，將剩余空間灌滿后立即將梳子插入濃縮膠中；插梳子時要使梳子保持水平，濃縮膠凝固的過程中要補膠1～2次。待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕拔出梳子，用水沖洗一下濃縮膠，將其放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。取出含50μg蛋白樣品與5×Loadingbuffer按比例充分混合，煮沸5min。加足夠的電泳液后用微量加樣器貼壁上樣，注意不要吸進氣泡。（2）電泳以初始電壓為80V進行電泳,30min，樣品進入分離膠后改為120～150V。在溴酚蘭泳動至距膠下緣約1cm時即可終止電泳（目的蛋白條帶一般跑過分離膠的1/3，可根據(jù)預(yù)染蛋白Marker調(diào)整電泳時間）。二、考馬斯亮藍染色電泳后的凝膠于染色液中振蕩染色4h或40℃染色1h，然后用蒸餾水將凝膠淋洗一次。多次變換脫色液直至凝膠背景脫凈為止，為加快脫色，可略加溫度。凝膠保存：脫去背景色的凝膠在保存液中浸泡30min，然后將凝膠放在玻璃板上，用保存液浸濕玻璃紙包住凝膠在室溫下干燥即可。免疫印跡（WesternBlot）【基本原理】WesternBlot中文一般稱為蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達情況的信息。WesternBlot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。【試劑配制】電轉(zhuǎn)液：Tris-base5.8g，Glycine2.9g，SDS0.37g，甲醇200ml，去離子水定容至1LTBS：20mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，室溫保存；TBST：即含0.05%Tween20的TBS緩沖液。封閉液與抗體稀釋液：均為含5%脫脂奶粉的TBST，溶解后4℃保存【操作步驟】轉(zhuǎn)膜將PVDF膜在甲醇中浸泡3min，完全浸濕后置于入轉(zhuǎn)膜液中。將膠平鋪于海綿上，按圖示順序鋪上膜與每側(cè)1～2張濾紙，注意用玻璃棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分。從負(fù)極（黑色板）依次鋪海綿-濾紙（3層）-膠-PVDF膜-濾紙（3層）。將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾子的黑面對轉(zhuǎn)移槽的黑面，夾的白面對紅面。將轉(zhuǎn)移槽置于冰水混合物中，300mA，1.5h(同時放入冰袋，外面包冰)。以預(yù)染蛋白Marker觀察轉(zhuǎn)移效果。注意：①轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套；②整個操作均在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡；③膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路；④注意轉(zhuǎn)膜時電極方向是“膜正膠負(fù)”。二、免疫反應(yīng)封閉：將PVDF膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與TBST稍加漂洗，浸沒于封閉液(脫脂奶粉5%)中緩慢搖蕩2h。傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。某些抗體用BSA封閉時因不明原因可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強的信號。結(jié)合一抗：將β-Actin一抗（兔抗人、鼠）用封閉液稀釋至適當(dāng)濃度（1：2000），室溫下作用2h或4℃洗滌：TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次，每次5～10min。結(jié)合二抗：按適當(dāng)比例（1：5000）稀釋HRP標(biāo)記的二抗（羊抗兔），室溫作用2h。洗滌：TBST漂洗膜后再浸洗2次，每次5～10min。DAB顯色（按產(chǎn)品說明書操作）二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶HRP（Peroxidase）的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物。用于檢測過氧化物酶的活性，靈敏度高，特異性好。其適用于蛋白質(zhì)雜交和免疫化學(xué)，以及原位雜交染色等。將配好的DAB直接滴加在目的片段位置，避光顯色至蛋白目的條帶明顯出現(xiàn)。將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。發(fā)光鑒定

Westernblot檢測系統(tǒng)中常用交聯(lián)酶兩大家族就是辣根過氧化物酶HRP-ECL或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP。堿性磷酸酶很早就被用于檢測系統(tǒng)-包括固定化抗原（WB）監(jiān)測和核酸檢測。但是做AP實驗經(jīng)常會遇到顯色背景偏高的問題，所以就WB本身來說偏愛HRP的要比AP多。AP顯色底物的生成物主要是藍紫色，成像好，容易拍照。但是背景也偏高，整個顯色過程更有技術(shù)性，有許多個人技巧在里面。如今由于HRP系統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)已經(jīng)不斷改進，使得靈敏度不斷提高，化學(xué)發(fā)光顯色上與AP不相上下。就生色反應(yīng)來說，AP顯色得靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。

1.HRP-ECL發(fā)光法：

將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底