豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法

DB33/T2269—2020

豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬圓環(huán)病毒2型與3型雙重?zé)晒舛縋CR的檢測方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬圓環(huán)病毒2型與3型的核酸檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3縮略語

下列縮略語適用于本文件。

Ct值：達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferSolution）

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）

PCV-2：豬圓環(huán)病毒2型（PorcineCircovirus2）

PCV-3：豬圓環(huán)病毒3型（PorcineCircovirus3）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

4試劑和材料

除非另有說明，所用試劑均為分析純；滅菌水，0.01mol/LPBS和8mmol/LNaOH配制中所使用的

水應(yīng)符合GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法中一級水的要求。

4.1DNAzolReagent：DNA抽提試劑，2℃～8℃保存。

4.2無水乙醇：4℃預(yù)冷。

4.375%乙醇：用無水乙醇和滅菌水配制，-20℃預(yù)冷。

4.48mmol/LNaOH溶液：配制方法見附錄A。

4.50.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法見附錄A。

4.62×PremixHSTaq（內(nèi)含PCRbuffer，HSTaq，dNTPs，Mg2+，RNaseH等）。

4.7陽性對照：豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒3型陽性克隆質(zhì)粒。PCV-3目的基因（ORF2）

序列見附錄A。

4.8空白對照：滅菌水。

4.9用于熒光定量PCR的引物濃度為10μmol/L，Taqman探針濃度5μmol/L，其序列分別為：

——PCV-2-F：5’-TCACCTATGACCCCTATG-3’；

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——PCV-2-R：5’-GGAAGTAATCAATAGTGGAATC-3’；

——PCV-2-P：5’-FAM-ACTCCTCTCGCCATACCATAACC-BHQ1-3’；

——PCV-3-F：5’-TGGCTCAACACATATGAC-3’；

——PCV-3-R：5’-ACGGACTTGTAACGAATC-3’；

——PCV-3-P：5’-HEX-TGCCGTAGAAGTCTGTCATTCCA-BHQ1-3’。

4.10一次性耗材：乳膠手套、1.5mL離心管、15mL離心管、熒光PCR反應(yīng)管和吸頭。

5器材和設(shè)備

5.1電熱干燥箱。

5.2高壓滅菌鍋。

5.3高速臺式冷凍離心機(jī)：可控溫至4℃，最大離心速度可達(dá)12000r/min以上。

5.4冷藏冰箱，超低溫冰箱（-80℃）。

5.5熒光PCR檢測儀。

5.6組織勻漿器。

5.7移液器。

5.8研缽。

6實(shí)驗(yàn)室分區(qū)

檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有相應(yīng)的生物安全設(shè)施和功能分區(qū)，包括樣品處理區(qū)、核酸提取區(qū)、試劑配制區(qū)和擴(kuò)

增區(qū)。各功能區(qū)有專用的試劑和實(shí)驗(yàn)材料，不可交叉使用。

7樣品的采集與處理

7.1采樣注意事項(xiàng)

采樣及樣品前處理過程中應(yīng)注意無菌操作，防止樣本交叉污染。

7.2采樣工具

藥匙、剪刀、鑷子，經(jīng)160℃干熱滅菌2h。

7.3采樣方法與處理

7.3.1內(nèi)臟樣品

采取病死或剖殺豬的主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟和腎臟）裝入15mL滅菌離心管中，按1：4

倍體積加入滅菌的0.01mol/LPBS。運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，再用研缽或組織勻漿器對組織進(jìn)行充分研磨混

勻，反復(fù)凍融3次。在4℃條件下以3000r/min離心20min，取上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中編號

備用，待檢。

7.3.2血清樣品

血清樣品無需處理，直接用于核酸提取。

7.4存放與運(yùn)送

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采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6h～8h之內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。采集或處理的

樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；需長期保存時，應(yīng)放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍

融不超過3次）。

8核酸提取

8.1一般要求

應(yīng)在核酸提取區(qū)進(jìn)行。

8.2DNAzol法抽提核酸

8.2.1取n個滅菌的1.5mL離心管，其中n為待檢樣品數(shù)、2管陽性對照及2管空白對照之和，對每

個離心管進(jìn)行編號。

8.2.2每管加入500μLDNAzol，分別加入待檢樣品、陽性對照和空白對照各250μL，顛倒10次混

勻，靜置5min；于4℃，10000r/min離心10min。

8.2.3取900μL上清，置于新的1.5mL滅菌離心管中，每使用1mLDNAzol，加500μL無水乙醇，

顛倒混勻5次～8次，室溫放置1min～3min；于4℃，5000r/min離心5min。

8.2.4棄上清，沿管壁緩緩加入1mL75%乙醇，顛倒混勻3次～6次，靜置0.5min～1min；4℃，

1000r/min離心2min。反復(fù)洗滌兩次后，將離心管倒扣于吸水紙上，自然晾干（以無乙醇味為準(zhǔn)）。

8.2.5用50μL8mmol/LNaOH溶液溶解沉淀，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

8.3核酸提取等效方法

可采用核酸提取試劑盒或自動化核酸抽提儀及配套核酸抽提試劑進(jìn)行核酸抽提。

9實(shí)時熒光PCR檢測

9.1實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增體系的配制

9.1.1在試劑配制區(qū)進(jìn)行。

9.1.2設(shè)PCR反應(yīng)數(shù)為n，其中n為待檢樣品數(shù)、2管陽性對照及2管空白對照之和，每個樣本測試反

應(yīng)體系配制見表1。配制完畢的反應(yīng)液分裝時應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，轉(zhuǎn)移至核酸提取區(qū)加樣。

表1每個樣品反應(yīng)體系配制表

體系組分用量

2×PremixHSTaq10μL

PCV-2-F0.4μL

PCV-2-R0.4μL

PCV-2-P0.8μL

PCV-3-F0.4μL

PCV-3-R0.4μL

PCV-3-P0.8μL

DEPC水4.8μL

總量18μL

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9.2加樣

9.2.1在核酸提取區(qū)進(jìn)行。

9.2.2在各設(shè)定的熒光PCR管中分別加入本標(biāo)準(zhǔn)8.2.5中制備的2μLDNA溶液，蓋緊管蓋后，3000

r/min離心30s；上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。

9.3實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增

9.3.1在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。

9.3.2將本標(biāo)準(zhǔn)9.2中離心后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣品擺放順序。

9.3.3循環(huán)條件設(shè)置：

a)95℃條件下預(yù)變性30s；

b)95℃條件下變性5s；60℃條件下擴(kuò)增30s，40個循環(huán)；60℃時設(shè)置采集熒光。

9.4熒光通道設(shè)定

PCV-2ReportDye設(shè)定為FAM，QuencherDye設(shè)定為BHQ；PCV-3ReportDye設(shè)定為HEX，QuencherDye

設(shè)定為BHQ。

10結(jié)果判定

10.1閾值設(shè)定

閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陽性對照品“S”型曲線指數(shù)擴(kuò)增初

期的熒光值為準(zhǔn)。

10.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陽性對照品FAM和HEX通道的Ct值均應(yīng)≤30.0，并出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線；空白對照品FAM

和HEX通道均無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線。陽性對照和空白對照同時成立可判定試驗(yàn)有效，否則試驗(yàn)

無效。

10.3結(jié)果描述及判定

10.3.1若被檢樣品FAM通道Ct值≤36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為PCV-2核酸陽性；若

被檢樣品FAM通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判定為PCV-2核酸陰性；若被檢樣品FAM通道Ct

值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤38.0且出現(xiàn)

典型擴(kuò)增曲線者判為PCV-2核酸陽性，否則判為PCV-2核酸陰性。

10.3.2若被檢樣品HEX通道Ct值≤36.0，且出現(xiàn)典型的“S”型擴(kuò)增曲線，判定為PCV-3核酸陽性；若

被檢樣品HEX通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判定為PCV-3核酸陰性；若被檢樣品HEX通道Ct

值＞36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤38.0且出現(xiàn)

典型擴(kuò)增曲線者判為PCV-3核酸陽性，否則判為PCV-3核酸陰性。

4

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

配制方法

A.18mmol/LNaOH溶液的配制

稱量0.32gNaOH，溶解到1000mL二級水中，混勻，分裝，常溫保存。

A.20.01mol/LPBS（pH7.2）的配制

稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，氯化鉀（KCl）0.2g，氯

化鈉（NaCl)8g，加二級水定容至1000mL，完全溶解后用3mol/L的NaOH調(diào)pH為7.2，經(jīng)121℃（±2℃），

高壓滅菌15min，室溫保存。

A.3PCV-3目的基因（ORF2）序列

ATGAGACACAGAGCTATATTCAGAAGAAGACCCCGCCCAAGGAGACGACGACGCCACAGAAGGCGCTA