淺談對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的理解

淺談對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的理解實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RT-qPCR)是一種實(shí)時(shí)監(jiān)控DNA擴(kuò)增反應(yīng)的技術(shù)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，并將DNA的累積速率繪制成動(dòng)態(tài)變化圖，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量，從而消除了在測(cè)定終端產(chǎn)物豐度時(shí)有較大變異系數(shù)的問(wèn)題。該項(xiàng)技術(shù)于1996年由美國(guó)AppliedBiosystems公司推出，促使PCR技術(shù)從定性到定量的飛躍，而且集特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、靈敏度好、污染少等優(yōu)點(diǎn)為一體，現(xiàn)已在生物研究、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。RT-qPCR的基本原理和應(yīng)用基本原理RT-qPCR的分類(lèi)方法根據(jù)其化學(xué)原理可分為探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩種,下面以TaqMan探針類(lèi)和SYBRGreenⅠ非探針類(lèi)兩種常見(jiàn)方法簡(jiǎn)述其原理。TaqMan探針?lè)═aqMan探針是一種長(zhǎng)度為20-24bp寡核苷酸探針，在其5′末端標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)(reporter,R)，在3′末端則標(biāo)記一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入TaqMan熒光探針,其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間,只與模板特異地結(jié)合。當(dāng)完整的探針與目標(biāo)序列雜交時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)與3′端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進(jìn)行延伸反應(yīng)時(shí),聚合酶的5′外切酶活性將探針進(jìn)行酶切,將DNA探針逐個(gè)降解，使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分離。這樣PCR體系中熒光的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量之間呈正比,可通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度而對(duì)PCR產(chǎn)物定量。如下圖1-1至圖1-11所示為T(mén)aqMan探針工作原理簡(jiǎn)圖：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET能量激發(fā)光淬滅基團(tuán)激發(fā)光圖STYLEREF1\s圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s11切斷的探針，檢測(cè)到報(bào)告熒光圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s12完整的探針，檢測(cè)不到報(bào)告熒光圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s13變性圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s14退火圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s15延伸（1）具有5′-3′外切酶活性5′-3′外切酶活性5′-3′外切酶活性圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s16延伸（2）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s17延伸（3）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s18延伸（4）圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s19延伸（5）報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離而發(fā)光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離而發(fā)光圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s110延伸（6）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s111延伸（7）SYBRGreenⅠ染料法SYBRGreenⅠ熒光染料是一種非飽和菁類(lèi)熒光素，可以嵌合于DNA雙鏈的小溝區(qū)域，其最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)。因此，根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量。如圖1-12和圖1-13為SYBRGreenⅠ工作原理簡(jiǎn)圖:圖STYLEREF1\s圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s112SYBR染料處于游離狀態(tài)圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s113SYBR染料與雙鏈DNA分子結(jié)合兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)總而言之，探針類(lèi)是利用與靶序列特異性結(jié)合的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)則是利用熒光染料或特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但價(jià)格昂貴。后者可以與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此設(shè)計(jì)的程序通用性好,且價(jià)格相對(duì)較低，更簡(jiǎn)便易行。特別地，由于SYBRGreenI與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性?？梢酝ㄟ^(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化幫助降低非特異產(chǎn)物的影響，由解鏈曲線來(lái)分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量結(jié)果。RT-qPCR技術(shù)的主要應(yīng)用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域RT－qPCR技術(shù)目前應(yīng)用最為廣泛的是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括病原體的檢測(cè)，例如病毒、細(xì)菌、病原體的定量監(jiān)測(cè)及治療藥效評(píng)價(jià)；基因的點(diǎn)突變及單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析；臨床疾病的診斷，如各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病診斷，腫瘤基因的檢測(cè)和診斷等。植物中的應(yīng)用RT－qPCR技術(shù)是一種很好的檢測(cè)基因表達(dá)的方法，通過(guò)RT－qPCR可以分析植物在不同處理?xiàng)l件下基因樣本的表達(dá)差異，也可以分析植物在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的差異。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用對(duì)植物病理學(xué)研究和植物遺傳育種研究起到了推進(jìn)作用。食品安全應(yīng)用RT－qPCR技術(shù)對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)和研究，不僅可以對(duì)活體微生物核酸量進(jìn)行檢測(cè)，還可以對(duì)已死的生物進(jìn)行檢測(cè)。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用也使得轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)突破了從定性到定量的界限。其他科學(xué)研究此外，RT－qPCR技術(shù)在其他分子生物學(xué)相關(guān)定量研究領(lǐng)域的應(yīng)用也取得了較大進(jìn)展，如：在動(dòng)植物基因工程、微生物鑒定與分類(lèi)、昆蟲(chóng)分類(lèi)和鑒定中的應(yīng)用及昆蟲(chóng)檢疫等。一般實(shí)驗(yàn)步驟在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR前，主要有RNA樣品抽提、RNA質(zhì)量檢測(cè)、樣品cDNA的合成，引物設(shè)計(jì)合成及其他藥品購(gòu)買(mǎi)，選擇合適的熒光定量方法等。在正式試驗(yàn)前需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以確定擴(kuò)增效率（一般大于1.9為有效）、動(dòng)力學(xué)范圍，確保準(zhǔn)確度、精密度。接著需要做的有：梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR、制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板、待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR、電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶及數(shù)據(jù)分析。特別地，學(xué)院現(xiàn)有的7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀可同時(shí)實(shí)現(xiàn)特異性靶基因檢測(cè)與定量。7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采用96孔反應(yīng)板或單個(gè)及8聯(lián)管，反應(yīng)體積25-100ul。該儀器將PCR熱循環(huán)，熒光檢測(cè)和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可以動(dòng)態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加的情況。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可以馬上得到定量結(jié)果，無(wú)需凝膠電泳分析和PCR產(chǎn)物純化。常見(jiàn)問(wèn)題分析如何甄別可疑的擴(kuò)增根據(jù)電腦自動(dòng)給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定樣品所含的目的DNA初始量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性應(yīng)該不小于95%。同一樣品的3個(gè)平行反應(yīng)所得出的Ct值之間的差值不應(yīng)大于0.5。甄別可疑擴(kuò)增還可以通過(guò)這三方面來(lái)判別，看擴(kuò)增曲線的形狀，正確的擴(kuò)增一般有明顯擴(kuò)增階段（特別是指數(shù)增長(zhǎng)期），所有的曲線有較好平行性。查看Y軸的數(shù)值，“可疑”曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期范圍常常是落在1e-2的范圍內(nèi)。看線性圖，曲線沒(méi)有明顯的上升趨勢(shì)則提示不存在正確擴(kuò)增。試驗(yàn)重復(fù)的問(wèn)題一般來(lái)說(shuō)，為了減少加樣以及實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的誤差，每一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)包含兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，即處理同樣的東西兩份，也有兩個(gè)相應(yīng)的對(duì)照。所以一般直接取平均值，若出現(xiàn)一個(gè)數(shù)值偏差，則去除離群值，取剩下的兩個(gè)值平均。若三個(gè)值分散都太大，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作可能存在問(wèn)題，需要重新實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)率低首先可以考慮是否加樣出現(xiàn)問(wèn)題，試劑混合均勻問(wèn)題、出現(xiàn)泊松分布，或者反應(yīng)體系過(guò)大、液體超出反應(yīng)孔平面，沒(méi)有使用ROX校準(zhǔn)等。擴(kuò)增曲線的斜率不一致一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，線性擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。只有在指數(shù)擴(kuò)增期，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，選擇該階段進(jìn)行定量分析。但如果在此階段擴(kuò)增曲線的斜率出現(xiàn)不一致，則提示可能樣本不好，即可能存在乙醇、蛋白酶等抑制物?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)量樣品260/280比值，重新檢測(cè)樣品質(zhì)量。另外，也可以考慮是否是因?yàn)榧訕硬粶?zhǔn)確，標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解、引物設(shè)計(jì)不好等問(wèn)題。如何判斷有無(wú)非特異性擴(kuò)增在染料法實(shí)時(shí)熒光定量時(shí)，可以根據(jù)溶解曲線進(jìn)行分析是否存在特異性擴(kuò)增。如果出現(xiàn)單一峰且峰值在Tm值位置出現(xiàn)，證明沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，且初始模板沒(méi)有被污染；如果出現(xiàn)多個(gè)峰，估計(jì)是有非特異性擴(kuò)增了或者初始模板被污染了。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，可能的原因有：樣本污染、引物特異性不好、形成了引物二聚體、鎂離子濃度過(guò)高等，根據(jù)可能出現(xiàn)的原因進(jìn)行逐一排除分析，改變條件。因退火溫度引起的非特異性擴(kuò)增，可以通過(guò)梯度PCR確定最佳退火溫度。另外，對(duì)于GC含量較高的片段，可以考慮加入適量二甲基亞砜（DMSO）提高DNA片段的特異性。熒光信號(hào)的讀取熒光信號(hào)的讀?。≒lateRead）是用來(lái)顯示PCR產(chǎn)物的濃度的，一方面來(lái)看，如果定量過(guò)程中發(fā)現(xiàn)PCR未出現(xiàn)擴(kuò)增，不僅僅應(yīng)該考慮模板或?qū)嶒?yàn)操作的問(wèn)題，還需把產(chǎn)物進(jìn)行電泳看看是否有條帶，以排除染料或探針的問(wèn)題而導(dǎo)致的未讀取信號(hào)。另一方面，熒光信號(hào)的讀取一般延伸步驟，但如果在該步讀取熒光值總是出現(xiàn)非特征峰，可以考慮在后面加一步高溫步驟（約80-85度）讀取熒光值。熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作一般儀器很難做到100拷貝以下的準(zhǔn)確定量，一般用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的最小濃度為1000拷貝，以確?？煽啃?。其他問(wèn)題在實(shí)驗(yàn)中特別要注意實(shí)驗(yàn)的清潔，戴手套防止試劑污染。另外，也要注意儀器使用的規(guī)范，嚴(yán)格按照操作流程使用。先開(kāi)電腦，待電腦完全啟動(dòng)后再開(kāi)啟定量PCR儀主機(jī)，等主機(jī)面板上的綠燈亮后即可打開(kāi)定量PCR的收集軟件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)結(jié)束后，首先關(guān)閉信號(hào)收集軟件，然后關(guān)掉定量PCR儀主機(jī)的電源，最后關(guān)閉電腦。參考文獻(xiàn)[1]周曉麗,朱國(guó)坡,李雪華,王艷玲,劉興友.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理與應(yīng)用[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2010,02:87-89.[2]趙煥英,包金風(fēng).實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2007,04:492-497.[3]陳旭,齊鳳坤,康立功,李景富.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,08:148-155.[4]劉小榮,張?bào)?王勇平.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的理論研究及其醫(yī)學(xué)應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,02:329-332.[5]CuiY,WangXJ,GaoS,etal.TheApplicationofReal-timeFluorescentQuantitativePCRinPlant[J].HubeiAgriculturalSciences,2015.[6]徐小剛,劉雅婷.實(shí)時(shí)熒光定量PCR在植物病害中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,07:52-56.[7]王榮談,劉冬兒,厲建萌,張大兵,楊立桃.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中的應(yīng)用[J].植物生理學(xué)通訊,2009,06:591-597.[8]馬月萍,戴思蘭,馬艷蓉.熒光定量PCR技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào),2011,07:37-45.[9]程海星,郭月英,任霆,張靜,王樂(lè),張利霞,靳燁.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理及在食品檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,03:243-247.[10]吳永彬,肖維威,馬文麗.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2011,22(4):575-579.[11]RodriguezlazaroD,HernandezM.Real-timePCRinFoodScience:Introduction.[J].CurrentIssuesinMolecularBiology,2013,15(2):25-38.[12]雷永良,王曉光,葉碧峰,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在食品污染物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009(4):828-830.[13]趙潔,馬晨,席曉敏,張和平.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在腸道微生物領(lǐng)域中的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2014,12:61-66.[14]張晶,張惠文,張成剛.實(shí)時(shí)熒光定量PCR及其在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2005,06:1445-1450.[15]王光華,趙偉春,程家安.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在昆蟲(chóng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2008,12:1293-1303.[16]NestorovJ,Mati?G,Elakovi?I,etal.GeneExpressionStudies:HowtoObtainAccurateandReliableDatabyQuantitativeReal-TimeRTPCR/IZU?AVANJEEKSPRESIJEG