無(wú)病毒植物的培養(yǎng)

教學(xué)目標(biāo)和要求

(1）了解植物病毒危害和培養(yǎng)無(wú)病毒植物意義。（2）了解和掌握脫除植物病毒原理及方法。（3）了解分離莖尖培養(yǎng)情況。（4）普通掌握無(wú)毒苗木判定方法。（5）普通掌握脫毒苗木保留和利用方法。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第1頁(yè)

第一節(jié)植物病毒危害和培養(yǎng)無(wú)病毒植物意義

病毒之所以致病不是因?yàn)橄募?xì)胞養(yǎng)分或經(jīng)過(guò)毒素殺死細(xì)胞，而是利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)占領(lǐng)空間，干擾細(xì)胞代謝過(guò)程，促使細(xì)胞產(chǎn)生一些對(duì)細(xì)胞或生物生命和正常功效有害異常物質(zhì)和條件，這使得植物病毒病防治較其它植物病害防治更為困難，常給生產(chǎn)帶來(lái)災(zāi)難損失，被稱(chēng)為“植物癌癥”。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第2頁(yè)一、植物病毒危害植物病毒已超出600種，嚴(yán)重危害著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。在果樹(shù)、蔬菜、花卉、林木以及農(nóng)作物上皆有發(fā)覺(jué)。伴隨生產(chǎn)栽培時(shí)間推移，危害越來(lái)越嚴(yán)重，發(fā)覺(jué)病毒種類(lèi)也越來(lái)越多。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第3頁(yè)病毒調(diào)查無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第4頁(yè)無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第5頁(yè)危害園藝植物病毒數(shù)目無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第6頁(yè)如侵染菊花病毒和類(lèi)病毒有19種之多如無(wú)子病毒(CAV)潛隱病毒(CLV)B病毒(CVB)輕斑駁病毒(CMMV)矮化病毒(CSV)脈斑駁病毒(CVMV)退綠斑駁類(lèi)病毒(CCMV)等無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第7頁(yè)4種對(duì)草莓生產(chǎn)造成重大影響:

斑駁病毒（SMoV）草莓黃邊病毒（SMYEV）草莓鑲脈病毒（SVBV）草莓皺縮病毒（SCrV）、無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第8頁(yè)甘薯根腐病.甘薯葉點(diǎn)病甘薯枯萎病甘薯黑痣病無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第9頁(yè)2.病毒特征及其侵染

多植物病毒不經(jīng)種子傳輸，多數(shù)以種子繁殖后代植物，能夠從輕度罹病植株上采集種子，播種繁殖，不會(huì)將病毒傳至下一代。（專(zhuān)化性強(qiáng)病毒除外，如豆類(lèi)病毒——由一個(gè)專(zhuān)化性強(qiáng)蚜蟲(chóng)傳輸)可伴隨種子傳輸。）對(duì)于有性生殖退化，僅能用無(wú)性繁殖方法繁殖植物，一旦罹病則毫無(wú)方法。母株一旦染病，病毒在其細(xì)胞內(nèi)增殖，并經(jīng)過(guò)插條、接穗、種薯、球根、鱗片傳至下一代。經(jīng)過(guò)昆蟲(chóng)作為媒介加速傳輸。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第10頁(yè)３.植株脫病毒意義植物組織培養(yǎng)脫病毒技術(shù)是植物細(xì)胞工程主要組成部分，脫毒種苗生產(chǎn)在提升作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面已顯示出極大潛力，良種、新品種脫毒組培苗大面積推廣和應(yīng)用，有效地處理了因病毒引發(fā)品種退化問(wèn)題。所以，植物組培脫毒技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)科學(xué)化、當(dāng)代化中含有巨大應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益，還可降低農(nóng)藥施用，改進(jìn)生態(tài)環(huán)境條件，預(yù)防病害蔓延與擴(kuò)散，該方法已成為農(nóng)業(yè)中應(yīng)用最廣泛生物技術(shù)。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第11頁(yè)甘薯脫毒苗無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第12頁(yè)脫毒區(qū)無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第13頁(yè)

第二節(jié)脫除植物病毒原理及方法

一、物理學(xué)方法：

X射線紫外線超短波高溫

都能使病素鈍化，其中以熱處理最慣用。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第14頁(yè)1.熱處理脫除植物病毒原理①病毒是DNA大分子，病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后；隨植物細(xì)胞DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死病毒，只能鈍化病毒活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停頓，而失去侵染能力。②熱處理是一個(gè)物理效應(yīng)，與冷處理一樣，它能夠加速植物細(xì)胞分裂，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖競(jìng)爭(zhēng)中取勝。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第15頁(yè)（1）溫湯浸漬處理法：將剪下接穗或種植材料，在50℃左右溫水中，浸漬3-15分鐘至數(shù)小時(shí)。（2）熱風(fēng)處理法：讓盆載植物在35-40℃高溫下生長(zhǎng)發(fā)育，熱處理空氣溫度應(yīng)逐步升高，然后到達(dá)所需溫度，同時(shí)必須保持一定濕度和光照，以后可切取處理后新長(zhǎng)出枝條作接穗和砧木，或?qū)崽幚砼c組織培養(yǎng)結(jié)合效果更加好。熱處理脫毒無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第16頁(yè)2、愈傷組織熱處理脫毒法

方法：從患病植株上取葉片(莖片、鱗片、花器亦可)進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后將愈傷組織重復(fù)繼代培養(yǎng)同時(shí)兼用熱處理。

慣用處理溫度及處理時(shí)間：溫度：37-38℃時(shí)間：處理2周、4周或8周溫度：50℃時(shí)間：3-15min。重復(fù)繼代兼熱處理，經(jīng)歷一定時(shí)間(繼代次數(shù)需試驗(yàn))后，將熱處理過(guò)愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)器官分化。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第17頁(yè)果樹(shù)作物：桃(無(wú)黃萎病)、蘋(píng)果(花葉病)、葡萄(扇葉病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、樹(shù)莓、紅莓苔子、草莓等。蔬菜作物：馬鈴薯、番茄、菠菜?；ɑ苤参铮郝L(zhǎng)春花、康乃馨、菊花等。其它植物：曼陀羅等。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第18頁(yè)

例：煙草愈傷組織兼熱處理鈍化煙草花葉病毒(TMV)和黃瓜花葉病毒(CMV)取得無(wú)病毒株效果做法：

A：從患病煙草植株上取5mm葉片培養(yǎng)，在MS附加IAA2+KT0.2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。B：將其中一部分愈傷組織重復(fù)繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)中分別兼用25℃、30℃和37℃溫度熱處理8周。C：將熱處理后愈傷組織，轉(zhuǎn)到MS附加IAA2+KT2分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化。D：將1cm長(zhǎng)芽轉(zhuǎn)移到MS附加IAA2+KT0.02生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根分化。E：完整植株取得后，移植到無(wú)毒土壤栽培并進(jìn)行判定。結(jié)果表明：重復(fù)繼代培養(yǎng)可取得無(wú)病毒株。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第19頁(yè)3.低溫處理脫出病毒菊花植株----5℃,4-7.5個(gè)月處理后進(jìn)行莖尖培養(yǎng),能夠除去矮化病毒(CSV)和褪綠班駁病毒(CCMV),而單獨(dú)莖尖培養(yǎng)無(wú)此效果。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第20頁(yè)

二、化學(xué)方法

使用農(nóng)藥是防治植物真細(xì)菌病害主要方法，理論上講，也應(yīng)該是防治病毒有效路徑。有不少化學(xué)物質(zhì)能抑制病毒復(fù)制，比如孔雀綠、硫尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、以及一些病毒抑制劑。如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白質(zhì)、核酸合成抑制劑等。因?yàn)椴《緩?fù)制和寄主代謝過(guò)程關(guān)系非常親密，所以，要找出既干擾病毒復(fù)制，又不影響寄主細(xì)胞正常代謝藥劑十分困難。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第21頁(yè)利用這些化合物處理整株植物去病毒效果雖不理想，但培養(yǎng)離體組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等卻可能有良好效果。如在培養(yǎng)基中加入2—硫尿嘧啶能夠除去煙草愈傷組織中PVY病毒，加入放線菌素D能夠抑制原生質(zhì)體中病毒復(fù)制等。

無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第22頁(yè)鈍化、抑制和去除植物病毒一些化合物無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第23頁(yè)

三、生物學(xué)方法

1.莖尖培養(yǎng)脫毒（1）莖尖培養(yǎng)脫毒理論基礎(chǔ)a、病毒在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)移是經(jīng)過(guò)維營(yíng)束系統(tǒng)完成，在分生組織區(qū)域內(nèi)沒(méi)有維管束組織，病毒只能經(jīng)過(guò)胞間連絲傳遞趕不上細(xì)胞不停分裂和活躍生長(zhǎng)速度；b、在分裂旺盛分生組織內(nèi)，病毒復(fù)制受到旺盛代謝活動(dòng)限制；c、在植物分生區(qū)域內(nèi)，“病毒鈍化體系”活性較其它部位活性高；d、莖尖分生組織內(nèi)高濃度植物內(nèi)源激素可能會(huì)抑制病毒增殖。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第24頁(yè)（2）莖尖培養(yǎng)脫毒苗方法在解剖鏡下剝?nèi)∏o尖?？紤]到脫毒效果及提升成活率，普通切取0.2—0.5mm莖尖為組織材料進(jìn)行培養(yǎng)，不一樣植物莖尖對(duì)外源激素反應(yīng)不一樣。莖尖大小:過(guò)大時(shí)接種易成活，但脫毒效果差，過(guò)小時(shí)難成活，但脫毒效果好。普通以帶有1-2片葉原基為好，大小為0.2-0.3mm為宜，超出0.5mm時(shí)，脫毒效果差。培養(yǎng)基:只要能使莖尖快速生長(zhǎng)，分化快培養(yǎng)基均適于脫毒。普通以MS很好，添加一定百分比細(xì)胞分裂素就行。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第25頁(yè)馬鈴薯芽無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第26頁(yè)莖尖結(jié)構(gòu)無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第27頁(yè)微莖尖普通莖尖無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第28頁(yè)馬鈴薯脫毒苗無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第29頁(yè)無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第30頁(yè)康乃馨不一樣莖尖培養(yǎng)與康乃馨斑駁病毒脫除情況無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第31頁(yè)(3)莖尖培養(yǎng)法脫除植物病毒技術(shù)關(guān)鍵①同一個(gè)病毒在不一樣植物體內(nèi)分布部位不一樣。例：煙草花葉病毒(TMV)在以下植物中熒光反應(yīng)。煙草：l-4片葉原基中未見(jiàn)TMY特異熒光撞羽矮牽牛：一兩片葉原基未見(jiàn)TMV特異熒光，而在三四片葉原莖中可見(jiàn)TMV熒光。番茄：1片葉原莖中未見(jiàn)TMV特異熒光。

所以在用莖尖培養(yǎng)脫毒時(shí)，必須認(rèn)真確定病毒在植物莖尖中分布部位，然后確定培養(yǎng)莖尖大小.無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第32頁(yè)如：番茄：只能取生長(zhǎng)錐或僅帶一片葉原基莖尖進(jìn)行培養(yǎng)；撞羽矮牽牛：可取生長(zhǎng)錐或帶一兩片葉原基莖尖進(jìn)行培養(yǎng)；煙草：可取帶4片葉原基莖尖進(jìn)行培養(yǎng)。

利用莖尖堵養(yǎng)法脫除植物病毒時(shí)，最好找出莖原基所帶葉原基數(shù)目與生長(zhǎng)點(diǎn)(莖尖)大小相關(guān)性，這么在取材時(shí)就方便多了。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第33頁(yè)莖原基0.05~0.08mm莖原基帶2片葉原基0.1~0.2mm莖原基帶4片葉原基0.3~0.4mm莖原基帶6片葉原基0.6~0.8mm無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第34頁(yè)②不一樣病毒種類(lèi)在同一個(gè)植物中分布部位不一樣。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第35頁(yè)甘薯斑紋花葉病毒、縮葉花葉病毒：分布于1.0-2.0mm以?xún)?nèi)莖尖中羽毛狀花葉病毒：

分布于0.3-1.0mm以?xún)?nèi)莖尖中馬鈴薯馬鈴薯卷葉病毒、Y病毒：分布于1.0-3.0mm以?xún)?nèi)莖尖中；X病毒：分布于0.2-0.5mm以?xún)?nèi)莖尖

G病毒：分布于0.2-0.3mm以?xún)?nèi)莖尖S病毒：0.2mm以下

無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第36頁(yè)2.愈傷組織培養(yǎng)脫毒植物各部位器官和組織培養(yǎng)去分化誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化產(chǎn)生芽，長(zhǎng)成小植株，能夠得到無(wú)病毒苗。說(shuō)明病毒顆粒會(huì)在愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中逐步消失。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第37頁(yè)愈傷組織脫病毒機(jī)理可能原因有：①病毒在植物體內(nèi)不一樣器官或同一器官不一樣組織中分布不均勻，由那些無(wú)病毒細(xì)胞增殖產(chǎn)生愈傷組織就是取得無(wú)病毒苗基礎(chǔ)。②有些愈傷組織細(xì)胞中病毒濃度較低，在愈傷組織細(xì)胞快速分裂過(guò)程中，病毒復(fù)制能力衰退或丟失。③繼代培養(yǎng)愈傷組織輕易產(chǎn)生抗性變異細(xì)胞，因而可能出現(xiàn)不帶病毒愈傷組織。但經(jīng)愈傷組織產(chǎn)生無(wú)病毒苗脫毒路徑輕易產(chǎn)生變異，可能造成植株喪失其原有優(yōu)良性狀，當(dāng)然也有可能產(chǎn)生有益變異，但頻率極低。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第38頁(yè)3.莖尖微體嫁接脫毒先將砧木種子進(jìn)行表面消毒，以后再接到1%瓊脂以MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽，用苗齡約2周幼嫩實(shí)生苗作砧木。把實(shí)生苗從試管中取出，在無(wú)菌條件下切去頂部，留下1-1.5cm上胚軸部分，將子葉和液芽除去，把根切短至4—6cm長(zhǎng)。從田間或溫室旺盛生長(zhǎng)成年樹(shù)剪取一小段新梢，經(jīng)消毒后在超凈臺(tái)上用顯微操作法取出僅帶1-3個(gè)葉原基莖尖約1mm大小作穗用。采取倒T字形水平切口。嫁接苗用液體濾低橋培養(yǎng)基培養(yǎng)。成活率30%—50%，嫁接成功植株移植到土壤之前最少要有兩片展開(kāi)真葉。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第39頁(yè)蘋(píng)果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第40頁(yè)蘋(píng)果不一樣取材時(shí)期對(duì)微體嫁接成功率影響無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第41頁(yè)蘋(píng)果微體嫁接莖尖大小與脫毒成功率無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第42頁(yè)試管微體嫁接在果樹(shù)方面發(fā)展最快

(1)嫁接植物不受與珠心及有性實(shí)生苗相關(guān)幼年階段影響。(2)許多栽培品種經(jīng)過(guò)嫁接繁殖了許多世代，所以果樹(shù)研究者和種植者關(guān)于這些品種自根苗根冠大小、病蟲(chóng)害情況以及耐寒性等了解得極少。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第43頁(yè)(3)莖尖組織培養(yǎng)繁殖結(jié)合熱處理可產(chǎn)生無(wú)病毒植物，所以，許多研究者認(rèn)為對(duì)通常采取嫁接繁殖果樹(shù)進(jìn)行試管嫁接是很適宜。(4)試管微體嫁接除了可培育無(wú)病毒植株外，還可處理難以生根園藝植物生根問(wèn)題和進(jìn)行嫁接親和力研究。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第44頁(yè)

4.珠心胚培養(yǎng)脫毒

柑桔類(lèi)80%以上種類(lèi)含有多胚性,而單胚占百分比很小。柑橘類(lèi)植物中有不少多胚品種，一顆種子內(nèi)除一個(gè)合子胚外，還有數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)由珠心細(xì)胞形成無(wú)性胚，稱(chēng)做珠心胚。因?yàn)椴《就ǔＪ墙?jīng)維管束韌皮組織傳輸，而珠心與維管束系統(tǒng)無(wú)直接聯(lián)絡(luò)。由珠心組織誘導(dǎo)產(chǎn)生植株就可免去病素毒危害。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第45頁(yè)①它與合子胚不一樣，不是受精產(chǎn)物，而是由體細(xì)胞產(chǎn)生，所以含有和母體相同遺傳組成；②與合子胚一樣，在珠心胚和植株之間無(wú)維管組織連系，所以即使母體植株感染了病毒，珠心胚也是無(wú)毒；③在自然條件下，珠心胚普通都不能發(fā)育成熟，只有適時(shí)從種子中剝離出來(lái)，接種在人工培養(yǎng)基上，珠心胚才能長(zhǎng)成植株，而這些植株應(yīng)該是不帶病毒母體無(wú)性系。珠心胚含有3個(gè)特征無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第46頁(yè)5.花藥培養(yǎng)脫毒花藥培養(yǎng)最初目標(biāo)，是培育起源于花藥內(nèi)部花粉粒單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料起源。但經(jīng)大量試驗(yàn)表明花藥培養(yǎng)所得植株有95%以上是能開(kāi)花結(jié)果多倍體，而且生長(zhǎng)發(fā)育都優(yōu)于母株。已證實(shí)，經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)出來(lái)花藥植株是不帶病毒，借此方法，不但可快速培育出大量無(wú)毒植株，并可省去病毒判定工作，對(duì)基層生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)為一舉兩得事情。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第47頁(yè)三、分離莖尖培養(yǎng)情況第一個(gè)：是生長(zhǎng)停頓，接種組織并有擴(kuò)大，顏色逐步變褐而枯死，這種情況大多是生長(zhǎng)點(diǎn)在分離接種過(guò)程中受傷而造成；第二種：是生長(zhǎng)太慢，莖尖接種后顏色逐步變綠，但不見(jiàn)增大，最終成綠色小點(diǎn)。這是因?yàn)樯L(zhǎng)素濃度偏低，或培養(yǎng)溫度過(guò)低所造成，假如馬上轉(zhuǎn)入較高濃度生長(zhǎng)素培養(yǎng)基中，或提升培養(yǎng)溫度，即能促進(jìn)莖尖生長(zhǎng)；無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第48頁(yè)第三種：是生長(zhǎng)過(guò)旺，接種后莖尖顯著增大，約培養(yǎng)一同后即在莖尖基部產(chǎn)生愈傷組織，但不易見(jiàn)到莖尖伸長(zhǎng)，組織顏色也較澆。這是因?yàn)榕囵B(yǎng)莖生長(zhǎng)素濃度偏高，或光照弱，溫度高而造成。為此應(yīng)將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)素濃度較低培養(yǎng)基中，或降低溫度，提升光照強(qiáng)度來(lái)處理。不然時(shí)間長(zhǎng)了愈傷組織會(huì)表?yè)Q生長(zhǎng)分化能力；第四種：是生長(zhǎng)正常、在營(yíng)養(yǎng)、激素、溫度、光照等各方面條件正常情況下，接種莖尖顏色逐步變綠，基部逐步增大，有時(shí)形成少許愈傷組織，莖尖也逐步伸長(zhǎng)，培養(yǎng)一個(gè)月左右轉(zhuǎn)入無(wú)基素基本培養(yǎng)基，莖尖繼續(xù)伸長(zhǎng)，并產(chǎn)生根系，最終發(fā)育成完整植株。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第49頁(yè)第三節(jié)無(wú)病毒植株脫毒程序一、材料準(zhǔn)備1．決定植物種類(lèi)及品種。選取生長(zhǎng)健壯，遺傳性一致品種為材料，并探明該品種除所脫除病毒在寄主中位置。2．了解該植物體內(nèi)所含有病毒種類(lèi)及危害程度。依據(jù)植物所帶病毒種類(lèi)，選擇指示植物(敏感植物)。3．決定脫除病毒方法：“莖尖培養(yǎng)”還是“熱處理”還是“微體嫁接”。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第50頁(yè)二、生長(zhǎng)點(diǎn)分離和培養(yǎng)(莖尖培養(yǎng)為例)

1．從罹病植株上切取頂芽或腋芽。2．材料表面滅菌、決定滅菌藥劑、濃度、時(shí)間。3．依據(jù)病毒在寄主內(nèi)分布位置決定切取莖尖大小。假如熱處理，那么決定熱處理溫度、時(shí)間。4．接種成功率與莖形狀結(jié)構(gòu)相關(guān)。例馬鈴薯、百合生長(zhǎng)點(diǎn)呈半圓形較大、好分離。番薯、矮牽牛、香石竹呈半圓形，也比很好分離。大麗花、菊花生長(zhǎng)點(diǎn)扁平、并被對(duì)生葉原基夾住難分離。草莓，葉原基上生有密集茸毛，生長(zhǎng)點(diǎn)埋在肉質(zhì)凹形槽內(nèi)，不但難分離且輕易污染。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第51頁(yè)三、無(wú)病毒植物判定

經(jīng)過(guò)莖尖分生組織培養(yǎng)、熱處理脫毒法、微體嫁接法而培養(yǎng)成植株，不一定都是無(wú)病毒植株。當(dāng)前用于病毒檢測(cè)方法有以下3種：①血清判定法；②生物判定法(敏感植物或指示植物)；③電子顯微鏡判定法。采取單一判定法并不十分可靠。尤其是對(duì)一些特異性病毒，單一判定方法可靠性更差。最好三種方法同時(shí)判定，能夠取得理想結(jié)果。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第52頁(yè)(一)指示植物判定法1、原理

指示植物法是利用病毒在其它植物上產(chǎn)生枯斑作為病毒種類(lèi)判別標(biāo)準(zhǔn)，也即枯斑和空斑測(cè)定法。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第53頁(yè)2、指示植物兩種類(lèi)型一個(gè)是接種后產(chǎn)生系統(tǒng)性癥狀，出現(xiàn)在病毒擴(kuò)展到植物非接合部位，通常沒(méi)有局部顯著病斑；另一個(gè)是只產(chǎn)生局部病斑，常由壞死、褪綠或環(huán)斑組成。慣用指示植物：千日紅、曼陀羅、豇豆、心葉煙、辣椒、莨菪等。

無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第54頁(yè)每種病毒都有自己敏感植物如：馬鈴薯病毒敏感植物：千日紅、黃花煙、心葉煙、毛葉曼陀羅；大蒜病毒敏感植物：藜、千日紅；草莓病毒敏感植物：威州草莓(從八倍體野生種選出)、野草莓、野紅草莓等。桃紅葉病毒敏感植物：旱金蓮。大麗花病毒敏感植物：昆落阿藜、莧色藜、心葉煙、克里芙蘭煙、矮牽牛、黃瓜。香石竹病毒敏感植物：昆落阿藜、莧色藜。菊花病毒敏感植物：矮牽牛、豇豆。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第55頁(yè)3、敏感植物判定病毒方法：

A、摩擦接種法：取培養(yǎng)植株葉片榨汁，將其汁用摩擦法接種到各自敏感植物上，然后視其病斑有沒(méi)有，來(lái)判斷是否脫除了病毒。接種后如若敏感植物葉片表現(xiàn)病斑，可依據(jù)病斑類(lèi)型判斷，還有哪種病毒沒(méi)有脫除。

無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第56頁(yè)例：馬鈴薯體內(nèi)各種病毒在其敏感植物上表現(xiàn)癥狀：X病毒侵染千日紅(葉片呈枯斑)；M、S病毒侵染千日紅(葉片呈突起枯斑)；X病毒侵染黃花煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染黃花煙(葉片花葉或條斑或呈顯著脈綠帶)；X病毒侵染心葉煙(葉片呈花葉)；Y病毒侵染心葉煙(葉片呈條斑)；P／G帶毒體侵染心葉煙(葉片呈花葉)；M、Y病毒侵染毛葉曼陀羅(葉片呈枯斑)。植物汁液摩擦接種后，如使千日紅葉片呈枯斑，使黃花煙、心葉煙葉片呈花葉證實(shí)，該植物體內(nèi)含有馬鈴薯X病毒。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第57頁(yè)B．嫁接法：有些病毒不是經(jīng)過(guò)汁液傳輸，而是經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)介體傳輸。如草莓黃化病毒、草莓叢枝病毒是經(jīng)過(guò)一個(gè)特殊蚜蟲(chóng)為介體進(jìn)行傳輸。這種病毒判定，需將培養(yǎng)植株芽嫁接在敏感植物上，依據(jù)敏感植物病癥表現(xiàn)來(lái)判斷是否脫除了病毒。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第58頁(yè)木本多年生植物及草莓等無(wú)性繁殖草本植物通常采取嫁接接種方法以指示植物作砧木，被判定植物作接穗，可采取劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法為多。如草莓以對(duì)病毒敏感歐洲草莓（野草莓）和深紅莓作指示植物，從經(jīng)脫毒得到植株上僅取成齡葉片頂端一小葉作接穗，葉柄用刀片削成楔形，削面長(zhǎng)8~10mm，然后快速將接穗小葉葉柄插入切口，用塑料綁縛接合部，嫁接后4周，若帶有病毒，則在新展開(kāi)葉片、匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病征無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第59頁(yè)

（二）抗血清判定法1、基本原理：當(dāng)動(dòng)物被病毒感染或人工注射異體蛋白質(zhì)時(shí)，在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一個(gè)特異性丙種球蛋白稱(chēng)為免疫球蛋白，即所謂“抗體”。引發(fā)形成抗體物質(zhì)(病毒或異體蛋白)稱(chēng)為“抗原”。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第60頁(yè)抗原和抗體結(jié)合，表現(xiàn)為很強(qiáng)特異性。即由一個(gè)病毒產(chǎn)生抗體，只能結(jié)合該種病毒?？贵w在特殊細(xì)胞內(nèi)形成，進(jìn)入血液存在于血清和體液內(nèi)。這種含有特異性“抗體”血清稱(chēng)為“抗血清”。抗原和抗體相結(jié)合反應(yīng)稱(chēng)為“血清反應(yīng)”。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第61頁(yè)2.病毒抗血清在診療上價(jià)值。

A.病毒抗血清含有高度專(zhuān)化性。即由一個(gè)病毒產(chǎn)生“抗體”，只能結(jié)合該種病毒(抗原)。如由注射(感染)TMV而產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)，只能檢測(cè)TMV病毒(才可能發(fā)生血清反應(yīng))。B．因?yàn)椤翱寡濉狈ê懈叨葘?zhuān)化性，所以對(duì)于那些受感染而沒(méi)有癥狀帶毒植物，也能診療，故在實(shí)用上含有很高價(jià)值。C．因?yàn)椴《九c“抗血清”“反應(yīng)量”與病毒濃度成正比。只要知道其中一個(gè)濃度，可依據(jù)反應(yīng)量來(lái)測(cè)定另一個(gè)濃度。故此能夠用來(lái)作病毒定量分析。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第62頁(yè)3.病毒抗血清在診療上不足：A.不是全部病毒都能制成抗血清，普通“黃化型”病毒，或嚴(yán)格由專(zhuān)化性昆蟲(chóng)傳輸病毒。如馬鈴薯卷葉病毒極難或不能取得“抗血清”。B．病毒在寄主體內(nèi)含量太少，而提純過(guò)程中喪失又太多。或者提純過(guò)程中，病毒質(zhì)粒喪失了必備抗原結(jié)構(gòu)。C．植物體內(nèi)含有單寧物質(zhì)，單寧與病毒結(jié)合，使病毒喪失了抗原性質(zhì)。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第63頁(yè)4.方法抗血清判定首先要進(jìn)行抗原制備，包含病毒繁殖、病葉研磨、汁液澄清、病毒懸浮液提純、病毒沉淀等過(guò)程。只有取得高純度抗原，才有可能取得高度純凈抗血清。普通采取家兔制備抗植物病毒抗血清，以9~24個(gè)月大小家兔為好，注射病毒懸浮液，在家兔饑餓12h后采血，再進(jìn)行抗血清分離和吸收等過(guò)程。血清可分裝在小玻璃瓶中，貯存在－15~－20℃冰凍條件下，也能夠分裝在安瓶中，冷凍干燥，然后密封，有效保留。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第64頁(yè)詳細(xì)測(cè)定可采取沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、熒光抗體技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等各種方法。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第65頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附法

(enzyme1inkedimmunOsOrbentassay，EL工SA)酶聯(lián)免疫吸附法是把抗原—抗體免疫反應(yīng)與酶催化反應(yīng)相互結(jié)合而發(fā)展起來(lái)一個(gè)綜合性技術(shù)，它靈敏度高，特異性強(qiáng)，尤其是當(dāng)寄主體內(nèi)病毒濃度很低或同時(shí)存在病毒鈍化物或抑制劑時(shí)，它優(yōu)勢(shì)尤為顯著，因而是近年來(lái)病毒檢測(cè)方法中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣一個(gè)方法。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第66頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附法原理利用以酶標(biāo)識(shí)特異抗體來(lái)指示抗原—抗體結(jié)合，從而檢出樣品中抗原。詳細(xì)操作程序是：將待檢植物汁液(抗原)注入酶聯(lián)板(聚苯乙烯多孔微量反應(yīng)板)中，使抗原吸附于它孔壁，然后加入以酶標(biāo)識(shí)特異抗體，待抗原與抗體充分反應(yīng)后，洗去未與抗原結(jié)合多出酶標(biāo)識(shí)抗體，于是在固相載體酶聯(lián)板表面就只留下以酶標(biāo)識(shí)抗原—抗體復(fù)合物。這時(shí)加入酶無(wú)色底物，復(fù)合物上酶催化底物降解，生成有色產(chǎn)物。這一結(jié)果可用肉眼識(shí)別，也可用分光光度計(jì)對(duì)底物降解量進(jìn)行測(cè)定。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第67頁(yè)血清判定法無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第68頁(yè)血清判定基本方法A.玻璃片凝集法在清潔玻璃片一端，用毛細(xì)管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量對(duì)照血清。然后各加滴被檢植物壓榨出原汁液兩滴。用玻璃棒攪勻，在常溫下靜置20-50min，然后在40-60倍顯微鏡下觀察。帶病毒葉綠體發(fā)生經(jīng)典凝集現(xiàn)象。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第69頁(yè)玻璃片凝集法無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第70頁(yè)B．微量凝集試驗(yàn)(MAT)在培養(yǎng)皿底部，鋪上一層火棉膠或聚乙烯醇縮甲醛薄膜，然后將抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆蓋一層石蠟油。在20—25℃下保溫，20-50min后觀察。此法優(yōu)點(diǎn)：判定時(shí)能夠完全防止蒸發(fā)，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培養(yǎng)皿能夠判定幾十個(gè)樣品。對(duì)一些病毒(馬鈴薯M病毒)引發(fā)細(xì)微病毒凝聚現(xiàn)象均可識(shí)別。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第71頁(yè)（三）電子顯微鏡檢驗(yàn)法采取電子顯微鏡，能夠經(jīng)過(guò)直接觀察，檢驗(yàn)出有沒(méi)有病毒存在，并能夠得知相關(guān)病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu),又能夠判定病毒種類(lèi)。這是一個(gè)較為先進(jìn)方法，但需一定設(shè)備和技術(shù)。。病毒

形態(tài)長(zhǎng)(nm)寬（nm）X線狀51513Y線狀73011A線狀73011S線狀65012~13M線狀65012~13無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第72頁(yè)靈敏度高和能在植物粗提取液中定量測(cè)定病毒。當(dāng)前利用負(fù)染和超薄切片電鏡觀察能夠診療和判別病毒到屬水平。1973年，Derrick把電鏡與免疫學(xué)技術(shù)相結(jié)合，建立了更為靈敏免疫吸附電鏡技術(shù)，該技術(shù)已成為植物病毒研究一個(gè)主要伎倆。方法優(yōu)點(diǎn)無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第73頁(yè)(四)分子生物學(xué)方法在植物病毒判定中采取分子生物學(xué)方法主要是檢測(cè)病毒核酸。普通都含有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。核酸雜交技術(shù)原理:采取帶有放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)識(shí)已知序列核酸單鏈作為探針，在一定條件下與靶病毒核酸單鏈退火形成雜交雙鏈。經(jīng)過(guò)雜交信號(hào)檢測(cè)，判定樣本中有沒(méi)有對(duì)應(yīng)病毒基因。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第74頁(yè)19世紀(jì)末以來(lái)，許多國(guó)家開(kāi)始用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)果樹(shù)病毒，并取得很好效果。慣用有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)技術(shù)，即利用已知病毒核苷酸序列或同組病毒相同序列區(qū)域來(lái)設(shè)計(jì)引物，將待測(cè)樣品用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA，擴(kuò)增后產(chǎn)物可進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNARAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)、變性梯度凝膠電泳(denaturinggradegelelectrophoresis，DGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationpolymorphism，SSCP)、探針交叉雜交等技術(shù)分析檢測(cè)病毒是否存在。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第75頁(yè)因?yàn)槎鄶?shù)植物病毒核酸是RNA，在進(jìn)行PCR檢測(cè)前，需以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，再利用病毒核酸特有序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，即可知道在寄主中是否有病毒存在。RNA病毒和類(lèi)病毒等在寄主體內(nèi)可形成雙鏈RNA(dsRNA)，而普通情況下植物體內(nèi)不存在dsRNA，所以dsRNA分析也可用于植物病毒判定。無(wú)病毒植物的培養(yǎng)第76頁(yè)利用DNA雜交和熒光標(biāo)識(shí)技術(shù)相結(jié)合基因芯片技術(shù)也是植物病毒快速檢測(cè)主要發(fā)展方向。在實(shí)際應(yīng)用中，為了提升檢測(cè)可靠性，往往用幾個(gè)方法同時(shí)判定。最終選擇出無(wú)毒苗即可進(jìn)行擴(kuò)增繁殖，用于生產(chǎn)。但在無(wú)毒種苗擴(kuò)增繁殖和應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)注