生命的奧秘基因治療專家講座

生命奧秘

AJourneyintoLife

上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生命的奧秘基因治療專家講座第1頁基因治療失明基因治療生命的奧秘基因治療專家講座第2頁

基因治療基本概念

基因治療發(fā)展歷程

基因治療策略基因治療流程基因治療應(yīng)用內(nèi)容生命的奧秘基因治療專家講座第3頁約3萬個基因

人類30億對堿基

(98％調(diào)控序列,2％信息序列)

約20萬種蛋白質(zhì)

基因組學(xué)

蛋白質(zhì)組學(xué)

基因：編碼蛋白質(zhì)和RNADNA序列。生命的奧秘基因治療專家講座第4頁“bubbleboy”生命的奧秘基因治療專家講座第5頁基因治療案例分析

成功案例第一例正式同意基因治療：先天性腺苷脫氨酶

（adenosinedeaminase,ADA）缺乏癥基因缺點嚴重聯(lián)合免疫缺點癥(SevereCombinedImmunodeficiency,SCID)

常染色體隱性遺傳病生命的奧秘基因治療專家講座第6頁SCID患者

夢

住在休斯敦得州兒童醫(yī)院隔離泡泡里。Bubbleboy:DavidVetter(1971-1984)

六歲時第一次走出了泡泡。隔著泡泡上課。David和他姐姐Katherine生命的奧秘基因治療專家講座第7頁ADA缺失SCID

T,B淋巴細胞缺點

成熟T細胞成熟 B細胞生命的奧秘基因治療專家講座第8頁ADA缺點→→脫氧腺嘌呤核苷酸代謝受阻→dATP↑ATP↑→抑制核糖核苷還原酶活性→阻止DNA復(fù)制和修復(fù)→T、B淋巴細胞增殖障礙。腺苷脫氨酶(ADA)

影響代謝路徑生命的奧秘基因治療專家講座第9頁1990年9月14日人ADA基因自體白細胞

患SCID4歲女孩第一例成功基因治療逆轉(zhuǎn)錄病毒載體美國國家心肺和血液研究所WilliamF.AndersonMichaelBlaeseKennethCulverAshantiDeSilvaADA恢復(fù)至正常水平5%-10%維持免疫系統(tǒng)改進癥狀Moloneymurineleukemiavirus生命的奧秘基因治療專家講座第10頁年AshantiDeSilva21歲，仍生存良好6歲照片AshantiDeSilvaBubblegirl離開無菌倉1991年，另一位SCID11歲女孩CindyKisik，接收了完全相同基因治療，取得成功。年，DeSilva（左）/Kisik（右）和Blaese醫(yī)生合影。生命的奧秘基因治療專家講座第11頁策略：將淋巴細胞ADA酶恢復(fù)至正常5-10%，維持免疫系統(tǒng)功效，改進病人癥狀。ADA缺乏基因治療策略和步驟步驟1）血液中單個核細胞分離。2）單個核細胞體外培養(yǎng)增殖。3）載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染T細胞；4）將轉(zhuǎn)染細胞回輸給患兒體內(nèi)。生命的奧秘基因治療專家講座第12頁為何選擇ADA缺點癥？發(fā)病機理明確單個基因缺點引發(fā)疾?。换虮硎菊{(diào)控簡單；基因過量表示無害，低表示也能足以治愈SCID。生命的奧秘基因治療專家講座第13頁一、基因治療基本概念基因治療：把基因轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)，使其發(fā)揮作用，以到達治療疾病目標。經(jīng)典：指正?；蛘先爰毎蚪M，校正或置換致病基因一個治療方法。廣義：改變基因結(jié)構(gòu)與功效，以到達治療疾病目標方法。生命的奧秘基因治療專家講座第14頁基因治療基本標準“隱性”遺傳疾病，導(dǎo)入正?；蚣纯杉m正缺點；正?；蛞芽寺。鼙硎居泄πМa(chǎn)物；治療基因體內(nèi)表示無需準確調(diào)控，表示產(chǎn)物過多無害；外源基因細胞，能自然消減，不成瘤，不產(chǎn)生額外病毒。生命的奧秘基因治療專家講座第15頁生殖細胞(germline)基因治療只限某一體細胞基因改變只限于某個體當代對缺點生殖細胞進行矯正當代及子代體細胞(somaticcell)基因治療長久影響不明，且包括倫理學(xué)問題生命的奧秘基因治療專家講座第16頁二、基因治療發(fā)展歷程“改變基因缺損：醫(yī)療美好前景”

——N.Engl.J.Med(1968)MichaelBlaese

準備期（1980年-1989年）

狂熱期（1990年-1995年）

理性期（1996年至今）生命的奧秘基因治療專家講座第17頁1980年，人β地中海貧血患者基因治療，沒取得好療效，也無不良反應(yīng)。1989年，首個獲批基因治療，將細菌新霉素抗性基因neoR導(dǎo)入腫瘤浸潤淋巴細胞，回輸患者體內(nèi)，

細胞存活了兩個月。1.準備期：1980年-1989年

腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL,tumorinfiltratinglymphocyte）生命的奧秘基因治療專家講座第18頁2.狂熱期：1990年-1995年

1990年9月——SCID患者首例成功基因治療

AshantiDeSilva，顯微注射ADA基因到淋巴細胞后再輸回患者體內(nèi)，四年后測得取得了正常人1/4免疫球蛋白。1999年第1個獲基因治療德謝爾瓦13歲。生命的奧秘基因治療專家講座第19頁法國巴黎奈克兒童醫(yī)院費舍爾博士與卡波博士也對兩例先天性免疫功效不全患兒成功地進行了基因治療。狂熱期，在短短幾年內(nèi)有100多個方案取得同意進入臨床試驗。1991年，我國首例基因治療B型血友病取得成功。生命的奧秘基因治療專家講座第20頁中國第一例基因治療1991年12月上海研究結(jié)果：血中凝血因子IX水平升高，癥狀緩解人凝血因子

IX基因

皮膚成纖維細胞

患血友病B

9歲和14歲男孩評價：中國第一例成功基因治療，是世界第二例逆轉(zhuǎn)錄病毒載體復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所&長海醫(yī)院薛京倫教授血友病B，即因子Ⅸ缺乏癥，X性染色體隱性遺傳疾病生命的奧秘基因治療專家講座第21頁3.理性期：1996年-至今1995年評定，100多項基因治療中，僅有幾項確證有療效。多角度對基因治療進行全方面研究。生命的奧秘基因治療專家講座第22頁載體安全性1999年9月UniversityofPennsylvania腺病毒引發(fā)強烈免疫反應(yīng)，患者4天后死亡。

JesseGelsinger

鳥氨酸甲?；D(zhuǎn)移酶基因患OTC缺點病

18歲男孩

腺病毒載體

動脈注射至肝臟鳥氨酸甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥是一個X連鎖隱性遺傳尿素循環(huán)疾病，氨中毒。生命的奧秘基因治療專家講座第23頁Wilson第二代腺病毒載體出現(xiàn)剔除E1,E3,降低腺病毒抗原性腺病毒基因組結(jié)構(gòu)與載體改造E1：病毒復(fù)制、包裝、反應(yīng)，強細胞毒性E2：DNA復(fù)制，E3:反抗宿主。ψ包裝信號，ITR末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列生命的奧秘基因治療專家講座第24頁第三代腺病毒相關(guān)表示載體穿梭載體腺病毒DNA重組腺病毒在工程菌中，基因同源重組合成重組腺病毒載體在HEK293細胞中重組載體包裝為病毒生命的奧秘基因治療專家講座第25頁世界首個上市基因治療產(chǎn)品深圳賽百諾企業(yè)CEO彭朝暉

年10月16日，重組人p53腺病毒注射液(Gendicine,今又生)取得國家食品藥品監(jiān)督管理局同意新藥證書。生命的奧秘基因治療專家講座第26頁1012個p53重組腺病毒顆粒(VP)

零售價為3380-3980元使用方法:放療前瘤內(nèi)注射，1支/周，1療程4支每支:用途:治療頭頸部腫瘤等

今又生82名鼻咽癌患者組別對照組試驗組人數(shù)40名42名治療放療放療＋今又生五年生存率59.2%66.7%五年無病生存率57%68.7%7.5%11.7%

生命的奧秘基因治療專家講座第27頁基因治療現(xiàn)實狀況年臨床試驗數(shù)目1843項生命的奧秘基因治療專家講座第28頁疾病種類基因種類生命的奧秘基因治療專家講座第29頁年9月16日3654例基因治療臨床試驗/生命的奧秘基因治療專家講座第30頁三、基因治療策略基因置換(genereplacement)基因增補(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)正?；蚪?jīng)過同源重組置換致病基因

單基因遺傳病

導(dǎo)入正?；?，與致病基因共存

導(dǎo)入原本不表示基因(自殺基因等)

單基因遺傳病腫瘤

導(dǎo)入反義RNA,siRNA,miRNA,核酶,反義DNA

生命的奧秘基因治療專家講座第31頁1.基因置換將特定目標基因?qū)胩囟毎?，?jīng)過定位重組，以導(dǎo)入正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有缺點基因。

對缺點基因缺點部位進行準確原位修復(fù)，不包括基因組任何改變。

同源重組基因靶向載體陽性篩選記號陰性篩選記號基因組DNA修飾后基因組DNA移除基因組部分插入基因組部分同源位點生命的奧秘基因治療專家講座第32頁基因置換正常基因經(jīng)同源重組技術(shù)定向替換缺點基因。用胚胎干細胞方法，同源重組率1/100萬→提升1/10。*MutatedAllele生命的奧秘基因治療專家講座第33頁2.基因添加

經(jīng)過導(dǎo)入外源基因使靶細胞表示其本身不表示基因。在有缺點基因細胞中導(dǎo)入對應(yīng)正常基因，原缺點基因保留。導(dǎo)入正常基因表示產(chǎn)物，賠償缺點基因功效；導(dǎo)入靶細胞原來不表示基因，利用其表示產(chǎn)物到達治療疾病目標。目標位點目標基因基因載體染色體生命的奧秘基因治療專家講座第34頁將“自殺”基因?qū)氚屑毎虮硎久改苁顾幤非绑w轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，殺死靶細胞自殺基因治療生命的奧秘基因治療專家講座第35頁導(dǎo)入自殺基因

單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因

大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(E.coli-CD)基因

旁觀者效應(yīng)5-氟胞嘧啶(5-FC)E.coli-CD5-氟尿嘧啶(5-FU)丙氧鳥苷(GCV)HSV-TKppp-GCV

“自殺基因”治療不但使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”腫瘤細胞相鄰未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”腫瘤細胞也被殺死。為何？生命的奧秘基因治療專家講座第36頁抑制某個基因表示，或者經(jīng)過破壞某個基因而使之不表示，以到達治療疾病目標。3.基因失活

導(dǎo)入反義RNA,siRNA,miRNA,核酶,反義DNA

廣義基因治療生命的奧秘基因治療專家講座第37頁基因緘默技術(shù)

反義DNA：結(jié)合靶DNA，封閉其復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。反義RNA：結(jié)合靶mRNA，封閉其翻譯。

核酶：能自我剪切RNA，錘頭、發(fā)夾狀。小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)：結(jié)合靶mRNA，使其降解。核酸免疫系統(tǒng)

微小RNA(microRNA,miRNA)：結(jié)合靶mRNA，封閉其翻譯。

基因失活生命的奧秘基因治療專家講座第38頁反義寡聚核苷酸（?類）

與mRNA特異性結(jié)合，阻斷翻譯過程反義寡聚核苷酸阻斷特異蛋白合成蛋白生命的奧秘基因治療專家講座第39頁四、基因治療流程選擇治療基因受體細胞（靶細胞）選擇和培養(yǎng)載體選擇將目標基因?qū)氚屑毎D(zhuǎn)移生命的奧秘基因治療專家講座第40頁1.選擇治療基因

多基因病（腫瘤、心血管病、糖尿病、肥胖等）

單基因?。ㄒ恍┻z傳?。┘臃ǎ骸叭笔裁囱a什么”標準(SCID、血友病、鐮狀貧血)減法：“多什么去什么”標準對致病主導(dǎo)基因做加減法(增補或抑制)

突變基因生命的奧秘基因治療專家講座第41頁易取和移植。血細胞、肌細胞；壽命長；易受外源基因轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)后回輸，易成活。體細胞生殖細胞×2.受體細胞（靶細胞）選擇和培養(yǎng)對生殖細胞進行基因治療，理論上講是根治遺傳病理想方法，但因為包括安全性和倫理學(xué)問題生命的奧秘基因治療專家講座第42頁當前慣用靶細胞造血細胞皮膚成纖維細胞肝細胞血管內(nèi)皮細胞淋巴細胞肌肉細胞腫瘤細胞生命的奧秘基因治療專家講座第43頁3.載體選擇將治療基因高效轉(zhuǎn)移入體內(nèi)、并調(diào)控其適度表示。慣用載體：病毒類和非病毒類。病毒載體：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，腺相關(guān)病毒載體等；非病毒載體：

脂質(zhì)體，受體介導(dǎo)等理化方法?；蜉d體選擇要求輕易生產(chǎn)連續(xù)表示弱免疫源整合能力能感染分裂期細胞和未分裂期細胞生命的奧秘基因治療專家講座第44頁粘性末端質(zhì)粒目標基因粘性末端匹配粘性末端分(分離)切(切割)生命的奧秘基因治療專家講座第45頁酶切后目標基因片段接(連接)連接后重組質(zhì)粒DNA分子生命的奧秘基因治療專家講座第46頁重組質(zhì)粒目標基因大腸桿菌轉(zhuǎn)(轉(zhuǎn)化)染色體真好玩!生命的奧秘基因治療專家講座第47頁篩(篩選)分解抗生素酶含抗生素培養(yǎng)基還活著!玩完啦!大腸桿菌大腸桿菌生命的奧秘基因治療專家講座第48頁大量生長提取大量質(zhì)粒酶切判定生命的奧秘基因治療專家講座第49頁基因克隆基本步驟分：分離目標基因和載體DNA。切：用適當酶切割上述二者，產(chǎn)生匹配末端。接：連接酶將目標基因裝入載體。轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)入宿主細胞。篩：篩選含有重組DNA分子陽性克隆。生命的奧秘基因治療專家講座第50頁病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率較高。。生命的奧秘基因治療專家講座第51頁逆轉(zhuǎn)錄病毒生活史基因組是單正鏈RNA，有逆轉(zhuǎn)錄酶，整合染色體生命的奧秘基因治療專家講座第52頁RNA去向翻譯:作為mRNA翻譯成病毒蛋白質(zhì)包裝：作為病毒RNA基因組被裝配成新病毒顆粒基因治療用逆轉(zhuǎn)錄病毒？生命的奧秘基因治療專家講座第53頁ψ

LTRgagpolenvLTRLTR:長末端重復(fù)序列(Longterminalrepeatsequence)

含增強子、開啟子、轉(zhuǎn)錄終止信號、PolyA

Ψ:包裝信號逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)和基因病毒結(jié)構(gòu)蛋白生命的奧秘基因治療專家講座第54頁env,pol,gag為活病毒所需基因載體構(gòu)建時剔除，只保留Ψ包裝信號逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建生命的奧秘基因治療專家講座第55頁

包裝細胞需穩(wěn)定表示病毒結(jié)構(gòu)蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在包裝細胞內(nèi)復(fù)制

重組病毒感染宿主后不再復(fù)制

包裝細胞復(fù)制出大量重組病毒顆粒病毒結(jié)構(gòu)蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白

包裝細胞——重組病毒“工廠”重組病毒核酸Ψ

LTR

LTR治療基因重組病毒顆粒(復(fù)制缺點)

生命的奧秘基因治療專家講座第56頁LTRφLTR目標基因標識基因134靶細胞LTRLTR目標基因標識基因5逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(核酸部分只能是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包裝細胞系2輔病毒

Ψ

包裝信號生命的奧秘基因治療專家講座第57頁4.將目標基因?qū)?/p>

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)病毒法：

病毒載體感染靶細胞。非病毒法：物理方法——顯微注射、電穿孔等；化學(xué)方法——脂質(zhì)體融合、受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用

生命的奧秘基因治療專家講座第58頁脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移示意圖缺點：脂質(zhì)體介導(dǎo)進入靶細胞內(nèi)，易被單核-吞噬細胞系統(tǒng)選擇性吞噬、降解。生命的奧秘基因治療專家講座第59頁基因治療路徑間接體內(nèi)治療路徑（exvivo）取出靶細胞，體外擴增后，將目標基因轉(zhuǎn)入，選擇高表示靶細胞擴增后回輸直接體內(nèi)治療路徑（invivo）將目標基因體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細胞。生命的奧秘基因治療專家講座第60頁基因治療兩種路徑載體目標基因invivoexvivo靶細胞生命的奧秘基因治療專家講座第61頁5.靶細胞回輸方式：靜脈注射、肌注、皮下注射、滴鼻等。淋巴細胞以靜脈注射回輸血液；將皮膚成纖維細胞以細胞膠原懸液注射至患者皮下組織；自體骨髓移植靜脈回輸血液；以將血管內(nèi)皮細胞定位輸入血管等。生命的奧秘基因治療專家講座第62頁基因治療應(yīng)用遺傳病基因治療腫瘤基因治療病毒性疾病基因治療生命的奧秘基因治療專家講座第63頁

1.遺傳病基因治療單基因缺點疾病僅限體細胞基因治療靶細胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內(nèi)治療效果應(yīng)勝過對病人危害表示水平無需調(diào)控且無副作用需經(jīng)動物試驗驗證安全可行當前可供選擇并符合上述4條以上要求不過只有30余種遺傳病生命的奧秘基因治療專家講座第64頁腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病血友病和其它血漿蛋白缺乏癥苯丙酮酸尿癥和其它先天性代謝缺點病萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征家族性高膽固醇血癥囊性纖維化病當前基因治療遺傳病生命的奧秘基因治療專家講座第65頁年11月3日，歐盟同意首個基因治療藥品Glybera脂蛋白脂肪酶缺乏癥（發(fā)病率～1/100萬）。接收一次治療后，可顯著降低致死性急性胰腺炎發(fā)病率。荷蘭UniQure研制，花費將高達125萬歐元。生命的奧秘基因治療專家講座第66頁，11月6日，F(xiàn)DA同意SparkTherapeutics基因治療產(chǎn)品SPK-RPE65。利伯氏黑蒙癥（Leber’scongenitalamaurosis）

RPE65基因突變致視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良致盲。21病人能夠?qū)Ω杏X到光，幾位經(jīng)三年治療已復(fù)明。治療費用$100,000/位。使用AAV單次注射眼睛生命的奧秘基因治療專家講座第67頁視網(wǎng)膜退化小鼠模型里。將視紫紅質(zhì)光敏蛋白表示在雙極細胞中。利用雙極細胞來看到外面世界。無可恢復(fù)視網(wǎng)膜治療方案生命的奧秘基因治療專家講座第68頁，9月10號，F(xiàn)DA經(jīng)過了血友病B型（缺乏凝血因子IX）DimensionTherapeutics企業(yè)產(chǎn)品生命的奧秘基因治療專家講座第69頁腫瘤是一類多步驟、多基因突變疾病，這些基因主要是編碼調(diào)控細胞周期各種蛋白因子基因。2.腫瘤基因治療癌基因（原癌基因）抑癌基因生命的奧秘基因治療專家講座第70頁

導(dǎo)入抑癌基因抑制過分表示癌基因?qū)朊庖咴鰪娀?細胞因子、共刺激分子)導(dǎo)入抑制血管生成基因(endostatin等)導(dǎo)入自殺基因

基因緘默技術(shù)

腫瘤基因治療策略生命的奧秘基因治療專家講座第71頁p53——基因組衛(wèi)士野生型p53

突變型

p53

抑癌基因癌基因點突變DNA損傷抑制細胞周期開啟DNA修復(fù)修復(fù)失敗

修復(fù)成功

誘發(fā)細胞凋亡

繼續(xù)細胞周期50%腫瘤相關(guān)性（1）導(dǎo)入抑癌基因今又生生命的奧秘基因治療專家講座第72頁RNAi作用機制經(jīng)過剪切mRNA或者抑制mRNA翻譯，下調(diào)靶基因表示水平。（2）抑制過分表示癌基因生命的奧秘基因治療專家講座第73頁腫瘤相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)RNA干擾（RNAi）生命的奧秘基因治療專家講座第74頁microRNA(miRNA)是一組由基因組編碼長度約20～23個核苷酸非編碼RNA，經(jīng)過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)緘默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或妨礙其翻譯。轉(zhuǎn)錄后負調(diào)控基因表示30%基因受到調(diào)控MicroRNA動物、植物，甚至在病毒中都發(fā)覺miRNA基因。生命的奧秘基因治療專家講座第75頁miRNA生物合成核內(nèi)胞漿生命的奧秘基因治療專家講座第76頁miRNAsAffectEverything?FrankSlackfrank.slack@發(fā)育時間分化衰老凋亡代謝癌癥生命的奧秘基因治療專家講座第77頁miRNAsasOncogenesandTumorSupressorsZhangetalDevBiol.Feb1;302(1):1-12癌基因抑癌基因生命的奧秘基因治療專家講座第78頁NatureMed11(7):713-714,.a：miRNA過分表示，抑制了抑癌基因正常表示；b：miRNA表示過少或缺失，不能有效抑制癌基因。abmicroRNAs經(jīng)過對抑癌基因和/或癌基因調(diào)控與腫瘤發(fā)生相關(guān)生命的奧秘基因治療專家講座第79頁DetaoWang,etal.miR-150,p53proteinandrelevantmiRNAsconsistofaregulatory

networkinNSCLCtumorigenesis.OncolRep;30(1):492-498.肺癌生命的奧秘基因治療專家講座第80頁英國AdaptimmuneTherapeutics多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤