病原學(xué)診斷與防治

病原生物學(xué)教研室DepartmentofpathogenicBiologyofGannanMedicalUniversity醫(yī)學(xué)微生物學(xué)MedicalMicrobiology1第八章病原學(xué)診斷與防治

第一節(jié)細(xì)菌學(xué)診斷第二節(jié)病毒學(xué)診斷第三節(jié)真菌學(xué)診斷第四節(jié)特異性預(yù)防與治療(自學(xué))

2第一節(jié)細(xì)菌學(xué)診斷細(xì)菌學(xué)診斷內(nèi)容包括:

?

查病原菌及其成分（抗原、產(chǎn)物、核酸）

——細(xì)菌學(xué)診斷（bacteriologicaldiagnosis）

?查特異性抗體

——血清學(xué)診斷（serologicaldiagnosis）

3一、病原菌檢測(cè)

（一）標(biāo)本采集與送檢原則?按疾病種類與病程采取不同標(biāo)本?無菌操作，防污染?在發(fā)病早期與用藥之前采取標(biāo)本

——對(duì)已使用抗菌藥物的患者標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)室要采取適當(dāng)措施

4?快速、冷藏送檢

——對(duì)少數(shù)菌要保溫送檢（如腦膜炎球菌、淋球菌等）?有特殊要求的細(xì)菌（如某些嚴(yán)格厭氧菌等）必須在特殊條件下送檢和保存。5（二）檢測(cè)方法1、形態(tài)結(jié)構(gòu)檢查2、分離培養(yǎng)鑒定3、抗原檢測(cè)4、其他檢測(cè)61、形態(tài)結(jié)構(gòu)檢查一般程序：

標(biāo)本涂片固定染色鏡檢（觀察鏡下特征：菌體形態(tài)、排列、染色性及特殊結(jié)構(gòu)等）初步鑒定

注：對(duì)形態(tài)、結(jié)構(gòu)、排列方式和染色性無特征的細(xì)菌，直接涂片染色鏡檢無意義

7主要技術(shù)（1）顯微鏡放大技術(shù)普通光學(xué)顯微鏡以可見光為光源分辨率：0.25μm

放大倍數(shù)：×10008

B.電子顯微鏡以電子流代替光波，電磁圈代替放大透鏡分辨率：1nm

放大倍數(shù)：×10萬以上電鏡標(biāo)本制作復(fù)雜，且必須真空干燥狀態(tài)下觀察

——不能觀察活的微生物9C.其他顯微鏡:

適用不同觀察目的暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦顯微鏡10（2）染色技術(shù)細(xì)菌易與帶正電荷的堿性染料結(jié)合而著色簡(jiǎn)單染色法：只用一種染料，過程簡(jiǎn)單，可觀察菌體形態(tài)、排列方式復(fù)合染色法：用二種或二種以上染料多步驟染色，能反映菌體內(nèi)部染色特征11革蘭染色法：革蘭陽性菌（紫色）、革蘭陰性菌（紅色）抗酸染色法：抗酸陽性菌（紅色）、抗酸陰性菌（藍(lán)色）特殊染色法：細(xì)菌莢膜、芽孢、鞭毛、細(xì)胞壁、核質(zhì)等染色12革蘭陽性菌(Grampositivebacteria)革蘭陰性菌(Gramnegativebacteria)涂片結(jié)晶紫染色碘液媒染酒精脫色復(fù)紅復(fù)染革蘭氏染色法（GramStain）由丹麥醫(yī)生HansChristianGram于1884年創(chuàng)立。1、步驟：13

2、分離培養(yǎng)與鑒定

（isolationandidentification）

一般程序：標(biāo)本（或增菌后）接種普通瓊脂平板血瓊脂平板選擇培養(yǎng)基平板培養(yǎng)特征：生長(zhǎng)條件菌落特征溶血環(huán)特征等染色鏡檢：根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定生化反應(yīng)：如腸道桿菌的乳糖發(fā)酵試驗(yàn)14血清學(xué)鑒定：鑒定細(xì)菌的種、型毒力鑒定內(nèi)、外毒素檢測(cè)動(dòng)物試驗(yàn)：家兔、豚鼠等藥敏試驗(yàn)紙片法：只可定性試管法：可定量（測(cè)MBC、MIC）

E-test：可定量（只可測(cè)MIC）153、抗原檢測(cè)（detectionofbacterialantigens）用已知Ab檢測(cè)待測(cè)Ag：特點(diǎn)：特異性強(qiáng)、敏感性高，Ag的檢出與病原菌的死活無關(guān)164、其他檢測(cè)：代謝產(chǎn)物的檢測(cè)：如氣相色譜法鑒定厭氧細(xì)菌

PCR檢測(cè)核酸基因芯片17二、血清學(xué)檢測(cè)用已知Ag測(cè)未知Ab

標(biāo)本：血清和其他體液診斷意義：雙份血清Ab效價(jià)4倍及4倍以上升高18

凝集試驗(yàn)：

Widaltest——診斷傷寒、副傷寒

Well-Felix——診斷立克次體病鉤體的顯微凝集試驗(yàn)

中和試驗(yàn)：抗“O”試驗(yàn)

ELISA常用方法：19第二節(jié)病毒學(xué)診斷病毒感染的檢測(cè)內(nèi)容查病毒查特異性Ab病毒顆粒病毒抗原病毒核酸病毒酶類：如逆轉(zhuǎn)錄酶電鏡直接觀察光鏡檢查包含體分離培養(yǎng)20一、標(biāo)本采集與送檢原則?按疾病種類與病程采取不同標(biāo)本?無菌操作，標(biāo)本用“雙抗”或加兩性霉素B

處理?在發(fā)病早期與用藥之前采取標(biāo)本?低溫保存，快速送檢，病變組織用50％甘油保存?血清學(xué)檢測(cè)采雙份血清

21二、病毒的分離與鑒定一般程序：標(biāo)本無菌處理動(dòng)物接種雞胚培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)指標(biāo)陽性指標(biāo)陰性病毒鑒定盲傳2－3代指標(biāo)陰性病毒陰性22（一）病毒分離培養(yǎng)方法1、動(dòng)物接種:

黑猩猩、猴、兔、鼠等優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物體內(nèi)常帶有潛伏病毒232、雞胚培養(yǎng):優(yōu)點(diǎn)：易管理,不帶微生物,成本較低缺點(diǎn)：操作程序復(fù)雜243.細(xì)胞培養(yǎng)(1)原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)組織組織塊分散的單個(gè)細(xì)胞單層細(xì)胞剪碎蛋白酶培養(yǎng)基(原代細(xì)胞)單層細(xì)胞(次代細(xì)胞培養(yǎng))傳代培養(yǎng)25病毒的細(xì)胞培養(yǎng)26

特點(diǎn):

A.對(duì)多種病毒敏感

B.生長(zhǎng)能力有限,獲取成本高

C.可攜帶潛伏病毒27(2)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)

體外分裂50-100代仍保持二倍體染色體數(shù)目?？捎糜诓《镜姆蛛x和疫苗生產(chǎn)特點(diǎn):

A.對(duì)多種病毒敏感

B.不帶異種蛋白(人源性)C.不帶病毒,無致瘤潛能

D.可傳代50代左右28(3)傳代細(xì)胞培養(yǎng)特點(diǎn):A.對(duì)多種病毒敏感性高

B.繁殖能力高,傳代時(shí)間長(zhǎng)

C.有致癌危險(xiǎn)，不能用于疫苗生產(chǎn)291.細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)Cytopathiceffectofenterovirus71andHSVincellculture:notetheballooningofcells.(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital,LindaStannard,UniversityofCapeTown)(二)病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變30CytopathicEffectSyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).（2）病毒感染細(xì)胞與鄰近細(xì)胞融合31（3）形成包涵體（inclusionbody）CytopathicEffect32Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.2.紅細(xì)胞吸附（hemadsorption,HAd）病毒包膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受體333.干擾現(xiàn)象（interference）風(fēng)疹病毒＋人胚腎細(xì)胞病毒增殖，CPE（－）?？刹《荆伺吣I細(xì)胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚腎細(xì)胞風(fēng)疹病毒？?？刹《綜PE(-)——風(fēng)疹病毒(+)

?？刹《?-)CPE(+)——風(fēng)疹病毒(-)

?？刹《?+)4.細(xì)胞代謝改變：病毒增殖，細(xì)胞代謝變慢，pH變化減慢34(三)病毒定量測(cè)定血凝試驗(yàn)：病毒總量（活病毒+死病毒）蝕斑測(cè)定（plaque）：ID50或TCID50(50%組織細(xì)胞感染量)：感染性病毒量35(一)標(biāo)本的采集淺部感染真菌：表層皮損組織（用70％酒精消毒）深部感染真菌：體液、分泌物、排泄物等(二)檢查與鑒定1、直接鏡檢：查孢子、菌絲表層角質(zhì)標(biāo)本：用10％KOH微加熱后鏡檢體液、分泌物、排泄物：離心后染色鏡檢第三節(jié)真菌學(xué)診斷362、分離培養(yǎng)：標(biāo)本處理大培養(yǎng)小培養(yǎng)菌落特征觀察觀察菌絲孢子特征鑒定生化反應(yīng)或分子生物學(xué)技術(shù)沙氏培養(yǎng)基373.動(dòng)物試驗(yàn)4.皮膚超敏反應(yīng)試驗(yàn)（三）真菌學(xué)快速診斷檢測(cè)真菌Ag、Ab檢測(cè)真菌核酸檢測(cè)真菌毒素38一、人工主動(dòng)免疫

用人工的方法將疫苗或類毒素等抗原性制劑接種于人體，使機(jī)體獲得特異性免疫力。用于預(yù)防。主要生物制品:死疫苗活疫苗類毒素基因工程疫苗轉(zhuǎn)基因植物疫苗亞單位疫苗

DNA疫苗重組載體疫苗合成疫苗第四節(jié)特異性預(yù)防與治療39死疫苗與活疫苗的比較區(qū)別點(diǎn)死疫苗活疫苗制劑特點(diǎn)死，強(qiáng)毒株活,無毒或弱毒株接種劑量與特點(diǎn)量較大，2~3次量較小，1次保存及有效期易保存，約1年不易保存，4℃

數(shù)周免疫效果較低，維持?jǐn)?shù)月~2年較高，維持3~5年甚至更長(zhǎng)40

用人工的方法注射含有特異性抗體的免疫血清、純化免疫球蛋白抗體或細(xì)胞因子等免疫制劑，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力。用于應(yīng)急性預(yù)防和治療。主要生物制品：抗毒素細(xì)胞免疫制劑抗菌血清胎盤球蛋白丙種球蛋白二、人工被動(dòng)免疫41區(qū)別要點(diǎn)人工主動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫免疫物質(zhì)抗原抗體或細(xì)胞因子等免疫出現(xiàn)時(shí)間慢，2~4周快，立即免疫維持時(shí)間長(zhǎng)，數(shù)年~數(shù)月短，2~3周主要用途預(yù)防治療或緊急預(yù)防人工主動(dòng)免疫與人工被動(dòng)免疫的比較42(一）抗菌藥物的種類生物來源分類：細(xì)菌、真菌、放線菌產(chǎn)生的抗生素按化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類①β-內(nèi)酰胺類④四環(huán)類②大環(huán)內(nèi)酯類⑤氯霉素③氨基糖苷類⑥喹諾酮類、磺胺類三、細(xì)菌感染的治療43影響細(xì)胞壁合成:β-內(nèi)酰胺類抗生素等。影響細(xì)胞膜的功能：多黏菌素、兩性霉素B等。影響蛋白質(zhì)的合成：

①作用于核糖體30S亞基②作用于核糖體50S亞基影響核酸代謝（二）抗菌藥物的主要作用機(jī)制44（一）抗病毒化學(xué)制劑1.核苷類似物：①無環(huán)鳥苷（阿昔洛偉）、丙氧鳥苷（庚昔洛偉）、噴昔洛偉：用于HSV感染引起的單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。②阿糖腺苷：用于HSV、VZV、CMV、HBV感染及HSV引起的角膜炎。四、病毒感染的治療45③病毒唑（3’-氮唑核苷）：用于流感病毒和呼吸道合胞病毒的治療。④碘苷（皰疹凈）：用于皰疹病毒引起的角膜炎。

⑤疊氮胸苷(Azidodeoxythymidine,AZT)、拉米夫啶：為HIV逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。46①抑制病毒基因復(fù)制：

a.模擬核苷成分摻入病毒基因組；

b.競(jìng)爭(zhēng)病毒復(fù)制酶。②抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄。核苷類藥物的作用機(jī)制：

472.非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑：奈非雷平3．蛋白酶抑制劑：沙奎那韋瓦、英地那韋4．其他：金剛烷胺、乙基金剛烷胺。抑制病毒的穿入與脫殼。48干擾素干擾素誘生劑中草藥IL-12、TNF等49反義寡核脫氧核酸（asODN）反義寡核苷酸（asON）核酶（ribozyme）siRNA（smallinterf