高良姜素對LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用

高良姜素對LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用［摘要］目的：探討高良姜素對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法：MTS法檢測細(xì)胞活性；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的分泌；免疫印跡（WesternBlot）法檢測NF-κB以及MAPK通路相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果：高良姜素在0-20μmol/L范圍內(nèi)對細(xì)胞活力無明顯影響。LPS的用藥濃度為500ng/mL；與LPS模型組相比，高良姜素2.5-20μmol/L能有效抑制炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的釋放（P＜0.05）；高良姜素20μmol/L能抑制NF-κB通路IκBα的磷酸化，從而減少核轉(zhuǎn)位因子NF-κB的核轉(zhuǎn)位，但對MAPK通路無影響；結(jié)論：高良姜素對LPS刺激的THP-1細(xì)胞炎癥具有一定的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與其調(diào)控NF-κB通路，抑制IκBα的磷酸化，減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而抑制TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的表達(dá)有關(guān)。［關(guān)鍵詞］：高良姜素；THP-1；脂多糖；抗炎；NF-κB;MAPK高良姜素(galangin)是一種天然的黃酮醇類化合物,近年來國內(nèi)外對該成分的藥理藥效活性進(jìn)行了大量研究,實驗證明高良姜素具有抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化等作用ADDINNE.Ref.{8BAD2C36-1F3B-44E6-A9EF-4178C212D7C7}[1-3]，而關(guān)于其抗炎活性方面的研究較少。巨噬細(xì)胞分泌多種炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，包括TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6ADDINNE.Ref.{D3D4D2DA-1820-4AAD-BF17-05F913DFBBB9}[4]等，而這些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生與NF-κB以及MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）通路有著密切的關(guān)系A(chǔ)DDINNE.Ref.{142AD3DF-9A60-4D40-A439-A1328A3D8183}[5,6]?；诖?，本實驗選用LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞作為體外炎癥模型，探討高良姜素在該模型中是否具有抗炎作用以及抗炎的機(jī)制。1.材料1.1.1藥品與試劑高良姜素（廣東省食品藥品檢驗所,批號62.111699）；THP-1細(xì)胞系購自上海細(xì)胞庫；LPS（sigma，批號L2880）；MTS（promega）；ELISA試劑盒（達(dá)科為）；IκBα、p-IκBα、p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、P38、p-p38、GAPDH、PCNA、NF-κB(P65)(cellsignalingtechnology)。1.1.2儀器超凈工作臺（Thermo）、細(xì)胞CO2培養(yǎng)箱（newbrunswick）、普通光學(xué)顯微鏡（Leika）、多功能酶標(biāo)儀（biotek）、臺式冷凍離心機(jī)（EppendorfResearch）、高壓蒸汽滅菌鍋（HIRAYAMA）、電泳儀（Bio-Rad）。2.方法2.1MTS法檢測高良姜素對LPS刺激后THP-1細(xì)胞增殖的影響：實驗分組：對照組、LPS刺激組（500ng/mL）、4個不同濃度高良姜素處理組（2.5、5、10、20μΜ/L）、4個不同濃度高良姜素（2.5、5、10、20μΜ/L）+LPS處理組。在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6、12、24h后,每孔加入20ulMTS溶液,繼續(xù)培養(yǎng)2-4h，酶標(biāo)儀測490nm下吸光度。2.2ELISA法檢測高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影響實驗分組（同2.1），分別培養(yǎng)6h、12h、24h，收集3個時間段細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書的要求進(jìn)行操作，最后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，測得的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦軟件處理。2.3高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞NF-κB通路以及MAPKs通路的影響實驗分組：空白對照組，500ng/mLLPS處理組（分別處理15min、30min、45min）、500ng/mLLPS+20μmol/L高良姜素組（分別處理15min、30min、45min）。根據(jù)實驗分組，制備蛋白上清，調(diào)整蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，孵育二抗，顯色，曝光。2.4高良姜素對LPS刺激后THP-1細(xì)胞NF-κB（P65）轉(zhuǎn)位的影響實驗分組：空白對照組、LPS（500ng/mL）組、20μmol/L高良姜素組、LPS+20μmol/L高良姜素組。藥物作用12h后，按照核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒說明書要求分別提取核蛋白以及胞漿蛋白，westernBlot法檢測NF-κB（P65）轉(zhuǎn)位，方法同2.4。2.5統(tǒng)計學(xué)處理采用spss13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，所有計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（±S）表示，組間差異只有兩組時用t檢驗，有多組時用單因素方差分析。以P＜0.05作為具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異的檢驗標(biāo)準(zhǔn)。3.結(jié)果3.1高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞增殖的影響空白對照組、LPS模型組、不同濃度高良姜素組（2.5、5、10、20μmol/L）、不同濃度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）+LPS組作用于THP-1細(xì)胞株6、12h后，與空白對照組比較，LPS模型組細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05），而不同濃度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）單獨(dú)作用對細(xì)胞活力無明顯影響（P＞0.05）。不同濃度高良姜素（2.5、5、10、20μmol/L）+LPS組與LPS模型組相比細(xì)胞活力無明顯變化（P＞0.05）。見圖1。與空白組相比#P＜0.05圖1：高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞增殖的影響（±S，n=3）3.2高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影響與空白對照組相比，LPS模型組THP-1細(xì)胞分泌TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6均顯著增加（P＜0.05）。給予高良姜素后，高良姜素能抑制TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的分泌（P＜0.05），并呈一定的濃度以及時間依賴性。見圖2。圖2A圖2B圖2C圖2D與空白組相比#P＜0.05，與模型組相比*P＜0.05圖2.高良姜素對LPS刺激后THP-1細(xì)胞表達(dá)TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6的影響（±S，n=3）3.3高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)NF-κB、MAPKs通路的影響與空白組相比，給予LPS刺激后15、30、45min，THP-1細(xì)胞表達(dá)p-ERK、p-P38、p-JNK、p-IκBα明顯增加，IκBα表達(dá)下降。高良姜素能抑制LPS刺激后的p-IκBα的表達(dá)，同時使IκBα的表達(dá)增加，而對p-ERK、p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)無明顯影響。見圖3。圖3.高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞表達(dá)NF-κB、MAPKs通路的影響3.4高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞NF-κB（P65）轉(zhuǎn)位的影響與空白對照組相比，LPS模型組胞漿內(nèi)NF-κB（P65）蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），胞核內(nèi)NF-κB（P65）蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與LPS模型組相比，高良姜素+LPS組胞漿內(nèi)NF-κB（P65）蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），胞核內(nèi)表達(dá)減少（P＜0.01），并呈一定的濃度依賴。見圖4。圖4A圖4B圖4C與空白組相比##P＜0.01，與模型組相比*P＜0.05**P＜0.01圖4：高良姜素對LPS刺激THP-1細(xì)胞NF-κB（P65）轉(zhuǎn)位的影響（±S，n=3）討論：脂多糖（LPS）又稱為內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,作為一種重要的外源性促炎成分，LPS與循環(huán)血中的LPS結(jié)合蛋白（LPSbindingprotein，LBP）結(jié)合后，作用于細(xì)胞膜受體，通過多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如NF-κB通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）通路活化單核巨噬細(xì)胞ADDINNE.Ref.{EA855688-B186-4FA0-B1A5-7BDF2A353D0C}[7]，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1等多種炎癥介質(zhì)生成ADDINNE.Ref.{688F7A16-3229-4F93-8683-39259F238B3F}[8-10]。TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1又稱為促炎細(xì)胞因子，處于炎癥瀑布反應(yīng)的中心位置，可活化內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞以及各種白細(xì)胞，引起組織細(xì)胞壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，高良姜素在0-20μmol/L濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞活力無明顯影響。LPS刺激THP-1細(xì)胞后，炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1表達(dá)顯著增加，高良姜素能夠抑制這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)，并具有一定的時間以及劑量依賴性，說明高良姜素具有抗炎活性。NF-κB通路以及MAPK通路是炎癥反應(yīng)過程中兩條重要的細(xì)胞通路ADDINNE.Ref.{2FA421DB-5418-4194-B46F-3B9C5E424970}[11,12]，與多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。NF-κB是早期核轉(zhuǎn)錄因子，屬于ReL家族，主要以P50/P65異源二聚體形式廣泛存在于真核細(xì)胞中。TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子是NF-κB的下游調(diào)控因子，NF-κB活化后可調(diào)控宿主細(xì)胞炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄。在靜息狀態(tài)下，NF-κB和IκBα形成復(fù)合體存在于胞漿中。當(dāng)受到刺激后，IκBα激酶復(fù)合體(IKBkinase，IKK)活化將IκBα磷酸化，使NF-κB與IκBα解離，游離的NF-κB迅速移位到細(xì)胞核ADDINNE.Ref.{3D335FB2-9B86-46AD-A31F-B48B32BD0D6E}[13]，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。MAPK通路是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號通路ADDINNE.Ref.{726F2B30-D4DE-4A6D-96FB-E989D89911F9}[14]。MAPK家族三條經(jīng)典的亞族通路分別是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38-MAPK）ADDINNE.Ref.{BCEC4609-E0DB-488C-8372-01D6CD950C5F}[15]。這些MAPK通路被LPS等多種因素激活后，通過復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生ADDINNE.Ref.{629609AB-C049-4B9B-B4E5-38076EF4AA8C}[16]。ERK、JNK、p38MAPK通路活化的標(biāo)志是其磷酸化形式表達(dá)量的增多。本實驗結(jié)果顯示，當(dāng)THP-1細(xì)胞受到LPS刺激后，THP-1細(xì)胞內(nèi)NF-κB、MAPKs通路活化，p-ERK、p-P38、p-JNK、p-IκBα表達(dá)明顯增加，相應(yīng)的ERK、P38、JNK、IκBα表達(dá)下降。應(yīng)用高良姜素后，高良姜素能夠抑制LPS刺激后的p-Iκ