SN∕T 4853.7-2017 轉(zhuǎn)基因大米定量檢測數(shù)字PCR法 第7部分：T1C-19品系

轉(zhuǎn)基因大米定量檢測數(shù)字PCR法I 本部分為SN/T4853標準的第7部分。1本標準規(guī)定了稻谷和大米中T1C-19品系的數(shù)字PCR定量檢測方法。本方法的定量檢測低限(LOQ)為0.1%(質(zhì)量分數(shù))。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/T19495.5轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測由樣和制樣方法SPS基因Thegeneofsucrosephosphatesynthase外源DNA插入受體大米基因組后經(jīng)重組產(chǎn)生的鄰接區(qū)序列。具體序列參見附錄A。源于水生棲熱菌的耐熱DNA聚合酶。在相對標準差不超過25%的條件下，檢測方法所能定量的最低轉(zhuǎn)基因成分百分含量。2依據(jù)樣品DNA溶液中的轉(zhuǎn)化體特異性序列(eventspecificsequence)和內(nèi)參照基因(species3擴增基因名稱序列(5'-3')片段長度SPS基因上游引物下游引物VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA體特異性序列上游引物下游引物FAM-TGTTTGCTTGGCTGTTTGCTCTCT注1:表中PCR體系中引物/探針的終濃度可根據(jù)每合成批次的驗證結(jié)果進4按照GB/T19495.7的規(guī)定執(zhí)行。采用PicoGreendsDNA熒光定量試劑盒或其他具有等效結(jié)果的儀器/方法測定DNA溶范圍內(nèi)的稀釋液分別用于SPS基因拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)化體特異性序列拷貝數(shù)的數(shù)字PCR定量檢測。8.4.1數(shù)字PCR體系配制終濃度內(nèi)源基因反應(yīng)體系SPS基因熒光標記探針(10pmol/L)dH?O(無菌水)5表2(續(xù))終濃度外源基因反應(yīng)體系dH?O(無菌水)注：數(shù)字PCR反應(yīng)體系的總體積可根據(jù)不同廠家，型號的數(shù)字PCR儀作相應(yīng)調(diào)整。PCR量避免產(chǎn)生氣泡。作說明生成微反應(yīng)體系。將微反應(yīng)體系放置于PCR擴增儀中，按以下參數(shù)進行PCR擴增：95℃,環(huán)；12℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。對微反應(yīng)體系進行熒光檢測，記錄陽性和據(jù)比值分別計算數(shù)字PCR反應(yīng)體系中的SPS基因拷貝數(shù)(拷貝/pL)和TIC-19轉(zhuǎn)化體特異性序列拷貝a)NC:采用非轉(zhuǎn)基因大米的基因組DNA作為數(shù)字PCR反應(yīng)模板；b)NTC:采用水作為數(shù)字PCR反應(yīng)模板；c)PC:采用質(zhì)控樣品的基因組DNA作為數(shù)字PCR反應(yīng)模板。每個測試樣和PC的SPS基因或T1C-19轉(zhuǎn)化體特異性序列的數(shù)字PCR須設(shè)置至少3個平行，且3個平行實驗結(jié)果的相對標準偏差應(yīng)不高于20%。b)PC的SPS基因或T1C-19610.1數(shù)字PCR儀運行后經(jīng)軟件計算得出每個測試樣的SPS基因拷貝數(shù)和T1C-19轉(zhuǎn)化體特異性序A——轉(zhuǎn)基因大米品系T1C-19的含量(%);10.2如兩個測試樣的T1C-19品系含量的相對相差大于或等于35%,則測試結(jié)果應(yīng)放棄，并應(yīng)重做樣品制備及后續(xù)試驗。相對相差的計算參照GB/T10.3如兩個測試樣的T1C-19品系含量的相對相差小于35%,則樣品的定量檢測結(jié)果等于兩個測試未檢出SPS基因檢出SPS基因，但未檢出T1C-19轉(zhuǎn)化體特異性序列檢出轉(zhuǎn)基因大米T1C-19品系成分，但的LOQ(0.1%)轉(zhuǎn)基因大米T1C-19轉(zhuǎn)化體特異性序列GATAAGCCAGGAGCAACTGT