(高清版)GB∕T 38480-2020 微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測定 菌絲生長速率法

ICS07.080微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測定菌絲生長速率法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T38480—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。1GB/T38480—2020微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測定菌絲生長速率法1范圍本標準規(guī)定了用菌絲生長速率法測定微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性的方法。本標準適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物抗真菌活性測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1抑制中濃度medianinhibitoryconcentrationIC50對真菌生長的抑制率達到50%時的濃度。3.2抗真菌活性antifungalactivity抗制真菌生長繁殖的能力。4原理將供試次生代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基混合，以培養(yǎng)基上菌落的生長速度來衡量次生代謝產(chǎn)物抑絲狀真菌的能力，通過計算IC?o來判定活性。5試劑或材料5.2馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。稱取馬鈴薯浸粉3.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g,然后將上述各成分加入1000mL蒸餾水中，煮沸溶解，pH自然，分裝至250mL錐形瓶中，121℃滅菌20min,備用。也可采用市售的商業(yè)培養(yǎng)基。5.3指示菌標準菌株：立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)ATCC76145。根據(jù)微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物應用領域不同，也可以采用其他菌株作為供試菌。2GB/T38480—20206儀器設備6.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差在±1℃以內(nèi)。6.2超凈工作臺。6.3無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。6.6無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器。7操作步驟7.1指示菌培養(yǎng)傾注融化并經(jīng)121℃滅菌冷卻至55℃左右的PDA固體培養(yǎng)基15mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，待其凝固后制成PDA平板，將立枯絲核菌凍存菌株用無菌接種針挑取少量菌絲接種到PDA平板中間，28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至菌絲覆蓋整個平板，備用。上述操作均在超凈工作臺內(nèi)進行。7.2供試樣品制備極性樣品直接用水充分溶解(非極性樣品加一定濃度的表面活性劑充分溶解),配制成一定濃度的濾膜過濾，然后用無菌水(或相應的表面活性劑)按2倍或5倍濃度逐級稀釋，制備成至少5個不同濃度的待測溶液，逐級稀釋時應確保既有抑制率大于50%分布的濃度點，也有抑制率小于50%分布的濃度點，現(xiàn)配現(xiàn)用。7.3檢測平板制備將7.2中制備的供試樣品分別用冷卻至55℃±1℃的PDA培養(yǎng)基按1:9的比例稀釋，充分混勻后用無菌吸管各取10mL移至無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕搖動培養(yǎng)皿使其均勻鋪平，待其凝固后制成檢測平板，用對應的溶劑和PDA混合制備的平板作為空白對照平板，備用。7.4抑菌活性測定用無菌打孔器(內(nèi)徑5mm±0.1mm)在活化的指示菌平板中相同的半徑邊緣打孔，用無菌鑷子取菌餅正置于7.3制備的檢測平板中間。每個處理重復5次。將平板正置于28℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h,取出，采用十字交叉法測量菌落直徑，兩次測量所得的平均值即為菌落直徑。8結果計算抑制率按式(1)計算：式中：………D?——空白對照平板中形成的菌落直徑，單位為毫米(mm);D?——供試次生代謝產(chǎn)物平板中形成的菌落直徑，單位為毫米(mm)